典型生活垃圾填埋场覆盖土微生物群落分析

中国环境科学2015,35(12)：3744~3753ChinaEnvironmentalScience典型生活垃圾填埋场覆盖土微生物群落分析何芝1,赵天涛1,2*,邢志林1,2,袁建华1(1.重庆理工大学化学化工学院,重庆400054；2.重庆大学城市建设与环境工程学院,重庆400030)摘要：采用第二代高通量测序技术IlluminaMiSeq对典型生活垃圾填埋场覆盖土样(山东莱芜,SD;广东深圳,GD;上海老港,SH;重庆长生桥,CQ)进行16SrDNAV3~V4区高通量测序,并分析了Alpha多样性、物种组成和丰度、菌群结构及环境因子对群落结构的影响.结果表明:取自垃圾填埋场GD土样的物种种类多于其他土样,GD、SD、SH、CQ土样的Shannon指数分别为5.52±0.026、4.76±0.030、4.89±0.037、3.43±0.027;所有覆盖土样的优势菌为Alphaproteobacteria(α-变形杆菌纲)和Betaproteobacteria(β-变形杆菌纲),所占比例范围分别为12.67%~25.54%,14.35%~18.88%;SD、GD和SH三种覆盖土样的优势菌为Sphingomonas(鞘氨醇单胞菌属),分别占7.25%、10.67%、11.30%;Deltaproteobacteria(德耳塔变形杆菌纲)和Gammaproteobacteria(γ-变形菌杆纲)的相对丰度分别与TN(r=1.00,P0.001)和TP(r=1.00,P0.001)呈正相关关系,且结合RDA图,TN、TP和OM含量可能是SD土样区别于其他土样群落组成的主要因素.关键词：IlluminaMiSeq测序；垃圾填埋场覆盖土；微生物多样性；群落结构；环境因子中图分类号：X505文献标识码：A文章编号：1000-6923(2015)12-3744-10Analysisofbacterialcommunitycompositioninlandfillcoversoil.HEZhi1,ZHAOTian-tao1,2∗,XINGZhi-lin1,2,YUANJiang-hua1(1.SchoolofChemicalEngineering,ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing400054,China；2.SchoolofCityConstructionandEnvironmentEngineering,ChongqingUniversity,Chongqing400030,China).ChinaEnvironmentalScience,2015,35(12)：3744~3753Abstract：Inthisstudy,thebacterialcommunitycompositionin4geographicallydifferentlocation(ShandongLaiwu,SD;GuangdongShenzhen,GD;ShanghaiLaogang,SH;ChongqingChangshengqiao,CQ)wasinvestigatedbyIlluminaMiSeqsequencingtargetingV3~V4regionof16SrDNAgeneandthelinkbetweenthebacterialcommunitycompositionandenvironmentalparameterswasanalyzed.ResultsshowedthatrepresentativesofAlphaproteobacteriaandBetaproteobacteriadominatedatall4coversoils,rangingfrom12.67%~25.54%and14.35%~18.88%ofthetotalabundance,respectively.CoversoilofGDhadhigherbacterialdiversitythantheothers,whichsuggestedbyShannonindex(5.52±0.026Vs4.76±0.030ofSD,4.89±0.037ofSH,and3.43±0.027ofCQ).GenusSphingomonasdominatedatcoversoilsofSD、GDandSH,accountingfor7.25%、10.67%、11.30%ofthetotalabundance,respectively.PersoncorrelationsuggestedthatgroupsofDeltaproteobacteriaandGammaproteobacteriahighlycorrelatedtototalnitrogen(TN)(r=1.00,P0.001)andtotalphosphorus(TP)(r=1.00,P0.001).Redundancyanalysis(RDA)furtherindicatedthatTN、TPandorganicmatter(OM)aretheimportantfactorsinshapingthebacterialcommunitystructure.Keywords：IlluminaMiSeqsequencing；landfillcoversoil；bacterialdiversity；bacterialcommunitystructure；environmentalfactors垃圾填埋气由200多种挥发性有机化合物组成,包括甲烷、二氧化碳、硫化氢以及痕量气体如C2-C10烷烃、C2-C4烯烃、芳香族和卤代烃类等有机化合物,排放于大气中会造成臭氧层空洞、温室效应等环境问题的加重.覆盖土微生物经填埋气长期驯化,对填埋气中有毒有害物质具有较高的耐受性,并且具备了能够降解烷烃、烯烃、芳香族等有害物质的能力[1],极大地降低了填埋气中污染物的浓度.Lakhouit等[2]模拟覆盖土层对垃圾填埋气中BTEX(苯、甲苯、乙苯、二甲苯同分异构体)挥发性有机物和OVOC(其他挥发性有机物)排放的影响,研究表明覆盖层收稿日期：2015-04-16基金项目：国家自然科学基金项目(51378522,41502328);重庆市基础与前沿研究项目(cstc2014jcyjA20007)*责任作者,教授,[e-mail]12期何芝等：典型生活垃圾填埋场覆盖土微生物群落分析3745对BTEX和OVOC的降解效率范围分别在67%~100%之间和96%~97%之间.张云茹等[3]对覆盖土中甲烷氧化菌氯代烃降解能力进行研究,结果表明三氯乙烯初始浓度为15.64μmol/L,反应时间为5d时,甲基孢囊菌Methylocystissp.JTC3对TCE的降解率为93.79%.微生物的群落结构及多样性是微生物生态学和环境科学研究的重点内容,对于开发生物资源,阐明微生物群落与其生境的关系,揭示群落结构与功能的联系,从而指导微生物群落结构功能的定向调控具有重要价值.由于覆盖土中绝大多数的微生物是不可培养或非活性状态存在,采用传统培养分离方法并不能代表该生境内真正的微生物多样性.而荧光原位杂交(FISH)、末端限制性酶切片段长度多态性分析(T-RFLP)、变形梯度凝胶电泳(DGGE)、基因芯片技术等[4]分子生物学技术虽能够绕开分离和培养,但受到样品大小、采集等因素的影响,且许多微生物需在分离培养后才能透彻的对其研究,进而阻碍了覆盖土微生物群落结构及多样性的研究[5].近年来,以测序通量高、成本低、定量准为特点的高通量测序技术(如Roche454测序技术、IIumina的MiSeq和HiSeq测序技术)的出现,使得微生物多样性及群落结构的研究更深入、更全面.Kim等[6]模拟垃圾填埋场覆盖层甲烷降解,通过基于DNA和RNA的核糖体标签焦磷酸测序对细菌群落进行分析研究,研究表明甲烷氧化菌活跃区域RNA占80%,而DNA占20%.大部分研究利用分子生态学方法(FISH、T-RFLP等)对垃圾填埋场覆盖土微生物进行研究.Su等[7]研究了甲烷和甲苯、甲烷、甲苯3种体系对垃圾填埋场覆盖土甲烷氧化菌群落结构及活性的影响,研究表明在3种体系中Proteobacteria和Bacteroidetes为优势菌,且甲烷和甲苯共代谢体系对甲烷氧化菌和甲苯降解细菌具有较大影响.多数关于填埋场覆盖土的研究都是基于覆盖土具有良好的甲烷生物氧化能力[8],而忽视了其他微生物在污染降解中的作用,他们既可降解其他非甲烷有机污染物,同时也能通过共代谢等作用影响甲烷氧化菌的活性.此外,不同土壤因氮磷含量、酸碱度、有机质含量及水分含量等的不同,其微生物群落结构及多样性具有一定差异.Zhang等[9]研究NH4+-N含量对覆盖土中微生物甲烷菌的影响,研究表明NH4+-N含量的增加会促进Methylobacter的生长.Liu等[10]研究表明pH值是土壤微生物群落变化的因素之一,然而大部分未测量的变化因素还未被解释到.据此,本文考察了国内华东、华南和西南地区的典型生活垃圾填埋场,基于不同地区垃圾填埋场覆盖土理化性质的不同,对微生物群落结构及多样性进行初步研究,分析细菌微生物群落结构在自然条件下覆盖土层中的演变规律,了解理化性质与微生物群落组成之间的关系,为功能菌筛选及填埋场覆盖层微生物降解优化工艺提供理论依据.1材料与方法1.1垃圾填埋场描述图1填埋场地理位置Fig.1Locationofstudylandfills选取了4个国内规模较大、填埋较规范的卫生填埋场进行采样分析,填埋场所处的地理位置不同、气候环境各有差异,具有一定的地域代表性.4个生活垃圾填埋场的地理分布情况如图1所示,山东莱芜(36°02′N,117°19′E)生活垃圾填埋场位于山东省中部,泰山东麓,占地面积为20×104m2,日处理量400t,使用期限超过20年[11];广东深圳(22°27′N,113°46′E)下坪生活垃圾填埋场位于深圳市罗湖区和布吉镇交接处,库容量为46.93×106m3,使用期限可达30年以上[12];上海南3746中国环境科学35卷汇区(31°2′N,121°4′E)老港生活垃圾填埋场占地面积为33.6×105m2,每天消纳城市生活垃圾6000~8000t[13];重庆南岸区(29°35′N,106°33′E)长生桥生活垃圾填埋场,占地69.14×104m2,库容12×106m3,使用期限超过20年[14].1.2土样的采集和处理土样的采集于2013年8月进行,均采集垃圾填埋场覆盖层10cm以下的土壤.山东莱芜、广东深圳下坪、上海老港和重庆长生桥城市生活垃圾填埋场覆盖土样分别编号为SD、GD、SH、CQ.用网孔为2mm的筛子将废物、石头等物质滤去,留下粒径较小的土样.每种土样取部分于50mL的离心管中,置于-20℃冰箱中以备DNA提取和土壤理化性质检测.1.3土壤DNA提取用MobioPowerSoil®DNAIsolationKit提取土壤样品中微生物总基因组DNA.并利用MobioPowerClean®DNAClean-UpKit完成对DNA的纯化.纯化后的DNA产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测.1.4PCR扩增以部分纯化后的DNA为扩增模板,用细菌16SrDNAV3~V4区通用引物(338F:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’及806R:5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)和TransGenAP221-02:TransStartFastpfuDNA聚合酶,使用ABIGeneAmp®9700型PCR仪进行扩增.20μLPCR反应体系中包括各0.8μL的引物,10μL的DNA模板,dNTPs(2.5mmol/L)4μL,0.4μLFastPfu聚合酶,4μL5×PCRbuffer.PCR扩增升温程序为:94℃预变性5min;94℃变性35s、59℃退火30s、72℃延伸35s,30个循