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1.电子显微镜的发展德国人Ruska1938年制造出一台真正实用的电子显微镜，其分辨率为10nm，比光镜提高了20倍。由于Ruska在电子显微镜方面作出的巨大贡献，他被誉为电子显微镜之父2.电子显微镜发展的理论基础Broglie的粒子波动性理论Busch的电磁场对电子具有会聚作用的理论3.电子显微镜的类型透射电子显微镜（TEM），扫描电子显微镜（SEM），扫描透射电镜（STEM）分析电子显微镜（AEM），高压电子显微镜（HVEM），扫描隧道显微镜（STM）原子力显微镜（AFM）4分辨率和有效放大倍数的关系M有=δ人眼/δ仪5影响分辨率的因素6电子束的特性电子波的波长和加速电压、分辨率的关系加速电压越高，波长越长7电子束与样品的相互作用透射电子（TE）、二次电子（SE）、背散射电子（BE）俄歇电子（AE）、X射线等电子信号的用途1.透射电子显微镜的结构电子光学系统（镜筒）、真空系统和电子学系统2.电子光学系统的组成和作用：1、照明系统（电子枪、聚光镜等）2、样品室3、成像放大系统（物镜、物镜光栏、中间镜、投影镜等）4、观察记录系统（观察室、照像装置、CCD等）3.成像原理振幅反差、相位反差、离焦反差衍射反差4.工作原理电子枪产生高能电子束--聚光镜控制光斑的大小和亮度--电子轰击样品--物镜聚焦透射电子--中间镜和投影镜放大--在荧光屏上将电子信号转成可见光形成图象5.提高生物样品图像反差的方法（5种）a，用金属盐来染色，以增加样品某些结构的质量厚度B，用重金属投影喷镀C，电镜观察中使用物镜光阑可以提高图像的反差，光阑越小，图像反差越强。D.降低加速电压。E.利用暗场显微方法。1.超薄切片制样的一般程序如下：取材，醛类固定，缓冲液清洗，锇酸固定，缓冲液清洗，梯度脱水，环氧丙烷置换，浸渍，包埋Epon812，聚合（60°C），修块和超薄切片，铀染色，铅染色2.取材的原则和基本要求1、取材部位要准确2、取材要迅速3、取材时的温度4、材料的体积要小5、取材时避免损伤3.常用固定剂种类及其性能------醛类、锇酸、高锰酸钾4.固定过程中需要注意的问题A.固定液的PH值B.固定液的浓度C.固定液的渗透压和离子组成D.固定液的温度和时间E.固定材料的大小5.电子染色剂的种类及其特性-------醋酸铀、柠檬酸铅，高锰酸钾，磷钨酸6.电子显微镜x射线微区分析技术制样方法A.对于生物硬组织，首先对其表面进行清洁，干燥处理，然后真空中喷镀200-400Ao厚的碳膜。B.对于悬浮液中的样品，可用涂片或喷协和的方法分散在支持物上，在进行空气干燥。C.含水较多的生物样品的制备通常使用冷冻干燥的方法来处理。1.负染色技术:通过重金属盐在样品四周的堆积提高样品外围的电子密度，衬托出样品的形态和大小。由于在电镜观察时，生物结构部分为透亮的，图像为负片，故称负染色2.负染色技术特点：具有分辨率高（可达20A°）、简单方便、快速的优点3.负染色剂具有不同的染色特性------磷钨酸（PTA）、醋酸铀等4.负染色的操作方法-------悬滴法、漂浮法、喷雾法5.影响负染色效果的主要因素（5点）A.样品的凝集问题B.样品的浓度和纯度C.样品悬液和复染液的酸碱度D.染色操作方法的影响E.镜检操作观察6.金属投影技术的特点：用这种技术制成的样品，因投影的效果，电镜下观察样品图像富有立体感，而且样品耐电子轰击。7.冷冻制样技术：利用低温冷冻方法处理样品的物理制样技术8.优点和缺陷：操作步骤少，时间短，适用于快速研究及诊断。操作技术难度大，成本较高。9.冷冻制样技术包括：冷冻真空干燥技术，冷冻取代技术，冷冻超薄切片技术，冷冻断裂蚀刻复型技术10.冷冻保护剂及作用：降低细胞内的含水量或提高细胞内液的浓度，从而缩小冷冻点与再结晶点之间的温度差。1.负染色技术:通过重金属盐在样品四周的堆积提高样品外围的电子密度，衬托出样品的形态和大小。由于在电镜观察时，生物结构部分为透亮的，图像为负片，故称负染色2.负染色技术特点：具有分辨率高（可达20A°）、简单方便、快速的优点3.负染色剂具有不同的染色特性------磷钨酸（PTA）、醋酸铀等4.负染色的操作方法-------悬滴法、漂浮法、喷雾法5.影响负染色效果的主要因素（5点）A.样品的凝集问题B.样品的浓度和纯度C.样品悬液和复染液的酸碱度D.染色操作方法的影响E.镜检操作观察6.金属投影技术的特点：用这种技术制成的样品，因投影的效果，电镜下观察样品图像富有立体感，而且样品耐电子轰击。1.扫描电镜的电子光学系统电子枪，灯丝对中线圈，聚光镜，扫描线圈,物镜及其光阑，消像散器，样品室2.扫描电镜的工作原理流程1、电子枪发射高能电子束聚光镜会聚，2、形成电子探针在偏转线圈作用下，3、电子探针作x、y扫描运动在物镜作用下，4、电子探针聚焦于样品表面电子探针逐点照射样品，5、产生连续的电子信号信号检测器收集、放大，6、将电子信号转换成电信号视频放大，在显像管上形成图像3.扫描电镜图像形成的基本原理电子束扫描照射样品时会产生反映样品特征或特性的各种信息，使用不同的检测器分别捕获这些信息，形成不同的图像，可以从不同的角度研究样品的特性。4.二次电子（SE）图像的形成-----几种效应：1、倾斜角效应2、边缘效应与尖端效应3、原子序数效应和组分效应4、加速电压效应5、充放电效应5.背散射电子（BSE）图象的特点：表现样品表面特征的同时可以反映样品元素成分的差异6.扫描电镜生物样品制备的基本要求1,样品观察表面必须真实2,样品必须干燥且不变形3,样品观察表面必须具有良好的导电性和较高的二次电子发射率1.扫描电镜生物样品制备的基本方法取样----清洗----固定----脱水----置换----干燥---粘样----镀膜2.镀膜的作用A,增加样品表面和样品台之间的导电性，以防止或减轻充放电效应B.减少电子束对样品的损伤C.增强二次电子发射率，提高图像的亮度和反差，提高分辨能力D.把二次电子信号来源限定在样品表面，防止样品内部信号混入，使图像更真实。3.干燥的方法：自然干燥法，真空，冷冻真空，化学真空，临界点干燥法4.样品导电处理的方法：物理--真空镀膜法，离子溅射镀膜法化学--组织导电技术5.电子显微镜的细胞化学技术：将细胞化学与电镜技术相结合，用于细胞组织学在超微结构水平上研究的一种技术。6.酶细胞化学的电镜技术按其反应原理大体分为：金属法,四唑盐法,二氨基联苯胺法7.无机离子的细胞化学技术：选用某种重金属离子与组织细胞中的无机离子发生特异性沉淀反应，在电镜下显示出该离子的存在部位，进行准确定位的技术。1，钙离子的定位2，磷酸盐离子的定位3，重金属离子的定位8.电子显微镜放射自显影技术：它是利用放射性同位素标记细胞化学物质，在超微结构水平上进行定位，定性和定量研究物质在细胞内合成，转移，代谢等过程。9.电子显微镜X射线微区分析技术：是借助于样品发出的元素特征X射线的波长或能量，在超微结构水平上对试样形态研究的同时，测定试样所含有的元素（定性分析），以及测定各元素特征X射线的强度，进行定量分析。10.元素的分析方法：点分析，线分析，面分析