短程硝化启动运行中功能菌群变化研究

微生物学通报MAY20,2012,39(5):597−605MicrobiologyChina©2012byInstituteofMicrobiology,[e-mail]基金项目：国家自然科学基金项目(No.50878072,51008111);河北省自然科学基金项目(No.E2009000709)*通讯作者：Tel:[phone];:[e-mail]收稿日期：2011-10-10;接受日期：2011-12-12研究报告短程硝化启动运行中功能菌群变化研究陈晓轩刘春杨景亮*张润杨辉娜(河北科技大学环境科学与工程学院河北石家庄050018)摘要:【目的】短程硝化-厌氧氨氧化是可实现的最短生物脱氮工艺,短程硝化是实现该工艺的重要环节和必要条件。【方法】采用序批式反应器(SBR)来实现短程硝化过程的启动和稳定运行,并对该过程中的相关功能菌群变化进行检测分析。【结果】通过控制低DO浓度(＜1mg/L)和逐步提高氨氮进水负荷,可抑制氨氧化细菌(NOB)菌群增殖并促进亚硝酸氧化菌(AOB)菌群规模显著扩大,实现短程硝化过程的启动和稳定运行。在氨氮进水负荷为0.055kg/(m3·d)时,平均氨氮去除容积负荷和污泥负荷可达到0.043kg/(m3·d)和0.16kg/(kg·d),平均亚硝酸盐积累率可达到83.4%。在短程硝化启动和稳定运行过程中,NOB菌群密度从2.0×105CFU/mL降至1.5×104CFU/mL,相对丰度从5.51%降至2.14%;AOB菌群密度从4.5×104CFU/mL增加至1.5×107CFU/mL,相对丰度从0.18%增加至7.25%。【结论】AOB菌群规模的扩大是实现短程硝化和氨氮去除能力提高的主要原因,同时较高的进水氨氮浓度和负荷也会造成亚硝化活性的抑制。关键词:短程硝化,AOB菌群,NOB菌群Variationoffunctionalbacteriaduringstart-upandoperationofpartialnitrificationprocessCHENXiao-XuanLIUChunYANGJing-Liang*ZHANGRunYANGHui-Na(SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang,Hebei050018,China)Abstract:[Objective]Partialnitrification-anammoxisconsideredastheshortestprocessfor598微生物学通报2012,Vol.39,No.5[Methods]Thevariationoffunctionalbacteriaduringstart-upandstableoperationofpartialni-trificationprocesswasinvestigatedinaSBRbioreactorinthisstudy.[Results]Theresultsindi-catedthatammonia-oxidizingbacteria(AOB)populationwasexpandedsignificantlyandni-trite-oxidizingbacteria(NOB)populationwasinhibitedwhenDOconcentrationwascontrolledlowerthan1mg/Landammonialoadingoftheinfluentincreasedgradually.Asaresult,start-upandstableoperationofpartialnitrificationprocesswasrealized.Whenammoniavolumetricloadingoftheinfluentwas0.055kg/(m3·d),theaverageammoniaremovalvolu-metricloadingandsludgeloadingwere0.043kg/(m3·d)and0.16kg/(kg·d),respectively.Inaddition,theaveragenitriteaccumulationratewas83.4%atthistime.AOBpopulationdensityandrelativeabundanceincreasedfrom4.5×104CFU/mLto1.5×107CFU/mLandfrom0.18%to7.25%,respectively,duringstart-upandstableoperationofpartialnitrificationprocess.Atthesametime,NOBpopulationdensityandrelativeabundancedecreasedfrom2.0×105CFU/mLto1.5×104CFU/mLandfrom5.51%to2.14%,respectively.[Conclusion]TheexpansionofAOBpopulationwasresponsibleforrealizationofpartialnitrificationandammoniaremoval.Higham-moniaconcentrationandloadingalsocausedtheactivityinhibitionofpartialnitrification.Keywords:Partialnitrification,AOBpopulation,NOBpopulation短程硝化-厌氧氨氧化是可实现的最短生物脱氮工艺,与传统的生物硝化/反硝化相比,该工艺可减少反应器的体积和占地面积,节省动力消耗,且不需要外加碳源。短程硝化提供亚硝酸盐的稳定积累,是厌氧氨氧化反应器稳定运行的前提。因此,实现短程硝化过程的启动和稳定运行是短程硝化-厌氧氨氧化生物脱氮工艺的重要环节。在氨氮向硝酸盐氮转化的硝化过程中,两类不同细菌共同发挥作用:一类是氨氧化细菌(AOB),又叫亚硝酸细菌,把氨氮转化为亚硝酸盐;另一类是亚硝酸氧化菌(NOB),又叫硝酸细菌,把亚硝酸盐氧化为硝酸盐。硝化过程中,可利用亚硝化菌群和硝化菌群对环境的不同要求[1],强化亚硝化能力,抑制硝化能力,将硝化过程控制在亚硝化阶段,可以实现短程硝化。研究表明,影响短程硝化的因素主要有DO、pH、温度和污泥龄(SRT)等[2−6]。DO对活性污泥系统短程硝化性能以及其种群结构有着显著影响。AOB菌群对氧的亲和力是NOB菌群的5倍,当DO在0.7−1.4mg/L时,氨氮的转化和亚硝态氮的积累都能达到90%以上[2−4]。此外,NOB菌群适宜的pH为6.0−7.5;而AOB菌群适宜的pH为7.0−8.5[5]。高pH有利于促进短程硝化启动和稳定运行:一方面适合AOB菌群生长的pH环境较高;另一方面由于高pH下游离氨和碱度较高,对NOB菌群的活性有一定的抑制作用,如pH值从7.5提高到8.5将会加重游离氨对NOB菌群的抑制作用[6]。传统的硝化菌数量的监测采用MPN法。目前,FISH技术也被广泛地应用于活性污泥系统、膜生物反应器和硝化流化床反应器等污水处理系统硝化细菌的检测[7]。孙红芳等[8]通过MPN法测定SBR中AOB与NOB的数量之比为103∶1。郑亚楠等[9]通过FISH检测出SBR中AOB的相对丰度为8%−9%,NOB的相对丰度为低于0.5%。短程硝化是通过抑制NOB菌群、富集AOB菌群来实现的,通过控制一定的运行条件,保持AOB菌群的快速富集和较高的活性,可以实现短程硝化过程的启动和稳定运行[10−12]。本研究在SBR中通过控制DO浓度和氨氮进水负荷,抑制NOB菌群增殖并促进AOB菌群规模扩大,实现短程硝化的启动和稳定运行,为短程硝化/厌氧氨氧化工艺提供技术参考。陈晓轩等:短程硝化启动运行中功能菌群变化研究599材料与方法1.1实验装置及运行条件本研究采用的SBR反应器有效容积12L,运行周期为12h,其中进水0.5h,曝气10h,沉降1h,出水0.5h。接种污泥是取自石家庄市某污水处理厂的二沉池污泥,初始接种污泥浓度为4.44g/L,污泥VSS/SS为0.67。实验用水为人工模拟废水[13],由硫酸铵提供氮源,碳酸氢钠提供碳源和碱度,运行温度为室温。反应器运行118d,分为4个阶段,具体情况见表1。1.2分析项目及检测方法1.2.1功能菌群检测:(1)FISH法取250μL的污泥样品置于1.5mL离心管中,加入3倍体积的4%多聚甲醛固定。4°C静置1h,10000r/min离心5min,弃去上清液,再用1×PBS缓冲液清洗样品3次,然后将污泥样品涂在载玻片上,分别用50%、80%和100%的梯度乙醇进行脱水,每个系列3min。将1μL浓度为0.1nmol/μL的探针(表2)与9μL杂交缓冲液(0.9mol/LNaCl,0.01%SDS,0.02mol/LTris-HCl,一定浓度的甲酰胺,pH7.2)充分混合,然后将探针与杂交缓冲液均匀展开在污泥样品上,再把载玻片放入预先平衡好温度和湿度的分子杂交箱(UVP,HB-1000,美国)中,46°C杂交4h。杂交好的污泥样品用46°C的杂交清洗液(0.01%SDS,0.02mol/LTris-HCl,一定浓度的NaCl,pH7.2)清洗未杂交的探针和杂交缓冲液,再用46°C的灭菌ddH2O漂洗3次,然后自然风干。杂交后的污泥样品置于荧光显微镜(Motic,BA200,中国)下观察,每个样品取30个视野获得FISH杂交图像(Moticam2206)。使用MoticFluo1.0荧光分析软件对图像进行分析,确定目标菌群的分布形态,并计算荧光杂交区域面积,根据公式(1)计算目标菌群的相对丰度[14]。(%)100%=×菌群相对丰度特异性探针杂交区域面积通用探针杂交区域面积(1)表1SBR中各阶段的运行条件Table1OperationconditionsofeachrunningstageinSBR运行阶段Runningphase运行时间Runningtime(d)进水平均氨氮浓度Averageinfluentammoniaconcentration(mg/L)进水平均氨氮负荷Averageinfluentammoniaload[kg/(m3·d)]碱度Alkalinity(mg/L)Run-11−6153.60.009300Run-262−8183.40.017500Run-382−96120.10.024700Run-497−118275.20.0551500表2FISH中用到的探针Table2ProbesusedinFISH探针Probe目标微生物Targetpopulation序列Sequence(5′→3′)标记种类Markertype文献ReferenceUNIV1392细菌和古菌ACGGGCGGTGTGTAC5′FITC[15]NSO190氨氧化细菌CGATCCCCTGCTTTTCTCC5'HEX[16]NIT3亚硝酸氧化菌CCTGTGCTCCATGCTCCG5′FITC[17]600微生物学通报2012,Vol.39,No.5(2)MPN法污泥中AOB菌群和NOB菌群密度采用MPN法测定[8,18]。1.2.2其他污染指标检测:氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、MLSS等指标的测