多环芳烃降解菌的分离鉴定及其生理特性研究

第32卷第5期2012年5月环　境　科　学　学　报　ActaScientiaeCircumstantiaeVol.32,No.5May,2012基金项目:国家自然科学基金项目(No.40971034,30800154);中国博士后科学基金项目(No.20080430794);甘肃省科技计划项目(No.1011FKCA114,1010RJZA009,2GS047-A52-012);甘肃省重大技术创新项目(No.[2004]197号,[2004]194号)SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.40971034,30800154),theChinaPostdoctoralScienceFund(No.20080430794),theScienceandTechnologyProjectsinGansuProvince(No.1011FKCA114,1010RJZA009,2GS047-A52-012)andtheMajorTechnicalInnovationProjectinGansuProvince(No.[2004]197,[2004]194)作者简介:杨轩(1986—),男,E-mail:[e-mail];∗通讯作者(责任作者),E-mail:[e-mail]:YANGXuan(1986—),male,E-mail:[e-mail];∗Correspondingauthor,E-mail:[e-mail]杨轩,张威,李师翁,等.2012.多环芳烃降解菌的分离鉴定及其生理特性研究[J].环境科学学报,32(5):1033-1040YangX,ZhangW,LiSW,etal.2012.Studyonisolation,identificationandphysiologicalcharacteristicsofPAHs-degradingbacteria[J].ActaScientiaeCircumstantiae,32(5):1033-1040多环芳烃降解菌的分离鉴定及其生理特性研究杨轩1,张威2,李师翁1,张满效2,3,∗,刘光锈2,陈拓2,胡平1,伍修锟2,台喜生2,陈伟11.兰州交通大学化学与生物工程学院,兰州7300702.中国科学院寒区旱区环境与工程研究所,兰州7300003.兰州石化职业技术学院,兰州730060收稿日期:2011-07-18　　　修回日期:2011-08-21　　　录用日期:2011-09-05摘要:从兰州石化污水处理厂的污泥中分离出一株能分别以萘、蒽为唯一碳源生长的细菌(BDP01).通过菌株形态观察及16SrDNA序列比对,确定该菌株属于假单胞菌属的绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa).菌株在LB培养基中48h内呈对数生长,48h到72h进入生长稳定期,72h后开始进入衰亡期;其最佳培养温度为30℃,最适生长pH为中性或弱碱性,该菌能在萘和蒽的质量浓度分别为100mg·L-1和50mg·L-1的无机盐培养基中良好生长,与已报道的其他微生物比较,BDP01在较短时间内具有较强的降解多环芳烃能力,1%的接种量15d内可降解89.64%的萘和77.21%的蒽.采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术检测到菌株基因组中有邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)基因.测序结果与NCBI数据库发布的C23O基因序列相似度为92%.该酶在20~65℃以邻苯二酚为底物时,细胞裂解液中酶活力变化范围为13.10~540.86U.关键词:污泥;萘;蒽;邻苯二酚2,3-双加氧酶;绿脓杆菌文章编号:0253-2468(2012)05-1033-08　　　中图分类号:X172　　　文献标识码:AStudyonisolation,identificationandphysiologicalcharacteristicsofPAHs-degradingbacteriaYANGXuan1,ZHANGWei2,LIShiweng1,ZHANGManxiao2,3,∗,LIUGuangxiu2,CHENTuo,HUPing1,WUXiukun2,TAIXisheng2,CHENWei11.SchoolofChenmicalandBiologicalEngineering,LanzhouJiaotongUniversity,Lanzhou7300702.ColdandAridRegionsEnvironmentalandEngineeringResearchInstitute,ChineseAcademyofSciences,Lanzhou7300003.LanzhouPetrochemicalCollegeofVocationalTechnology,Lanzhou730060Received18July2011;　　　receivedinrevisedform21August2011;　　　accepted5September2011Abstract:Astrain,designatedasBDP01,wasisolatedfromthesludgeofLanzhouSewageDisposalPlant.Itutilizednaphthaleneandanthraceneasthesolecarbonsourcesforitsgrowth.Basedonthemorphologicalcharacterizationsandalignmentanalysisofthe16SrDNAsequence,BDP01wasidentifiedasPseudomonasaeruginosa.Thegrowthcurveofthestrainwasinlogarithmicphasewithin48h,instationaryphaseafter48hto72h,andindeclinephaseafter72h,inLBliquidmedium.Thestraingrewwellininorganicsaltliquidmediumcontaining100mg·L-1naphthaleneor50mg·L-1anthracene.Theoptimalgrowthtemperaturewas30℃andtheoptimalgrowthpHvaluewas7~8,aneutraloralkalescentcondition.Thestrainhadastrongabilitytobiodegradepolycyclicaromatichydrocarbon.Inthepresentexperiment,whentheinoculumconcentrationofthestrainwas1%,thedegradationratesofnaphthaleneandanthracenewere89.64%and77.21%,respectively,afterculturedfor15days.Furthermore,catechol2,3-dioxygenasegenesequenceofthestrainwasdetectedusingthePCRmethodandagarosegelelectrophoresis.Thegenesequencingandalignmentanalysisshowedthatcatechol2,3-dioxygenasegenesequenceofthestrainhad92%similaritywiththeclosestC23OgenesequenceintheNCBI.Withcatechol环　　境　　科　　学　　学　　报32卷asthesubstrate,theactivityofcatechol2,3-dioxygenaseinthestraincellysissolutionwas13.10~540.86Uat20~65℃reactivetemperature.Keywords:sludge;naphthalene;anthracene;catechol2,3-dioxygenase;Pseudomonasaeruginosa1　引言(Introduction)多环芳烃(PAHs)是一类含有2个以上苯环,广泛分布于环境中的致癌、致畸、致突变的重要全球性污染物.由于部分PAHs具有持久性、生物累积性、可远距离传输、致癌致突变性和内分泌干扰等特性(Wangetal.,2007),并可通过生物累积和食物链的传递,对生态环境和人类健康构成重大危害,因而成为美国环保局制定的129种优先治理的污染物中的一类(Mcveetyetal.,1988).石油是由烷烃、环烷烃、烯烃、芳香烃等组成的复杂混合物,其中,多环芳烃是石油中最难降解的组分之一(廖雪义等,2010).由于人类对石化产品的不断开发利用,致使环境中多环芳烃污染物浓度在逐年增加,已经威胁到人类的身体健康(Raveletetal.,2001).在现代工业生产中,石化工业造成的污染是高浓度多环芳烃的主要来源,萘、蒽、菲、芘、苊等是石油化工中常见的多环芳烃化合物,同时在这些污染环境中也蕴藏着丰富的降解微生物,这些都是对多环芳烃污染进行生物修复的宝贵资源(Klankeoetal.,2009).由于多环芳烃的微生物修复具有价格低廉、设备简单、二次污染少、修复彻底等特点,已成为去除环境中多环芳烃的理想方法和重要手段(Simetal.,1989).目前,研究人员已从环境中分离出一些降解菌株,主要有Mycobacteriumvanbaalenii、Sphingomonas、Pseudomonas、Nocardioides、Burkholderia、Gordonia等,但得到的高效降解菌株不多(贾玉红等,2009),特别是从石化污泥中分离降解萘、蒽菌株的研究在国内外还鲜有报道.研究表明,绝大部分的PAHs主要是通过生物降解途径从环境中逐渐消失,因此,多环芳烃的生物降解备受关注(Deanetal.,2002),分离高效降解菌在PAHs的环境整治方面也就显得格外重要.Eder等(2008)从环境中分离出一株具有降解蒽能力的假单胞菌,该菌株在48d内可降解72%的蒽.Gennaro等(2001)发现混浊红球菌R7菌株(RhodoccocusopacusR7)可分别通过芳烃降解的龙胆酸途径和邻苯二酚途径,酶系催化萘和二甲苯的降解,具有既能降解双环芳烃萘又能降解单环芳烃二甲苯的能力,该特性的发现促进了降解芳烃的理论与应用研究.研究发现,邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)是多环芳烃化合物降解的关键酶,能作用于多用多环芳烃化合物的中间产物邻苯二酚,催化邻苯二酚的间位代谢途径,生成2-羟基粘康酸半醛(2-HMS),便于后续酶促降解反应的进行,对消除PAHs类化合物的污染具有重要作用(Toyamaetal.,2009;Juncaetal.,2003).Zhou等(2007)研究了一株可降解菲的细菌中邻苯二酚2,3-双加氧酶的耐热特性,由于基因序列的不同导致该酶在底物特性方面可能存在很大差异.因此,深入探讨不同细菌的C23O降解基因具有重要的理论意义,然而至今只有极少数研究将降解菌深入到基因水平(Songetal.,2009).基于此,本研究从兰州石化污水处理厂的污泥中筛选到一株可降解萘、蒽的细菌,命名为BDP01,通过对其形态观察和16SrDNA比对进行鉴定,并对该菌株的生长特性和降解特性进行研究.同时,利用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术检测到含有邻苯二酚2,3双加氧酶(C23O)基因片段的特异性条带,并对该酶的酶活进行测定,以期探讨BDP01对多环芳烃降解的分子机制,为更合理有效地开发利用微生物资源清除多环芳烃污染物提供科学依据.2　材料与方法(Materialsandmeth