洱海海舌湾沉积物中好氧反硝化细菌的分离鉴定研究张文

洱海海舌湾沉积物中好氧反硝化细菌的分离鉴定研究张文1申元英1王圣瑞2l(.云南省大理学院公共卫生学院,大理赵海超2,671000;2.中国环境科学研究院湖泊生态环境研究中心,北京100012;3.河北北方学院农林科技学院,张家口075131)摘要:用反稍化选择性培养基,从洱海海舌湾沉积物中分离出8株反稍化细菌。通过稍酸盐除去率,从中筛选出1株反稍化能力较强的菌株EH3一1一7。对该株细菌进行生理生化实验测定,该细菌接触酶(过氧化氢酶)试验、产硫化氢试验和淀粉水解均为阳性,葡萄糖氧化发酵试验结果为氧化菌,产脂酶(Tween80)试验结果为阴性,采用PCR分子生物学方法扩增出其16rSDNA片段进行测序,初步确定该菌株为假单胞菌属。由于洱海沉积物中存在大量具有较强的反稍化能力的细菌,通过反稍化作用,降低了沉积物对洱海上覆水中氮含量的贡献,从而使洱海上覆水保持较好。作为反稍化作用的主体,研究洱海沉积物中反稍化细菌将为后期治理洱海及预测洱海水体变化提供重要信息。关键词:洱海;沉积物;好氧反稍化细菌;16rSDNA硝化和反硝化过程是无机氮生物地化循环中的一个重要环节,它们通过微生物的生化过程将钱盐转化为溶解态的硝酸盐、亚硝酸盐,进而转化为气态氮和氧化亚氮,是完成氮生物地化循环的重要环节团。其反应物钱盐、硝酸盐、亚硝酸盐是引起水体富营养化的主要化学物质。近年来,国内外很多研究已证明细菌的反硝化作用不仅可在厌氧条件下进行,同时也可在好氧条件下进行团。云南洱海是云贵高原水环境相对较好的湖泊,但研究表明沉积物氮磷含量较高。洱海海舌湾位于洱海北部喜州湾附近,该湾水生植物非常茂盛,原来季节性有植物。因此本文从洱海海舌湾沉积物中分离筛选出一株好氧反硝化细菌,并对其进行鉴定,为后期反硝化细菌开发应用提供基础,并为控制内源释放提供理论基础。1研究区域概况洱海位于大理市境内,是云南省第二大高原淡水湖泊。洱海是大理市主要饮用水源地,又是苍山洱海国家级自然保护区和风景名胜区的核心,具有调节气候、提供工农业生产用水、水生生物多样性等多种功能,是整个流域乃至大理白族自治州经济社会可持续发展的重要基础,堪称大理人民的“母亲湖”队生〕。但是近几十年来,随着湖区经济的快速发展和人口的急剧增长,人类对其自然资源的不合理开发不断加剧,洱海生态系统良险循环结构遭到破坏,自净能力减弱,水体透明度降低,藻类大量繁殖,水质恶化,富营养化进程加剧,水质呈不断下降的趋势阮6〕。2004年,洱海全湖总氮平均浓度为基金项目:国家重大科技专项洱海项目(N。:2。。SZXO71OS)作者简介:张文(1985),男,甘肃白银人,硕士研究生·322·首届中国湖泊论坛论文集0.574mg/L,总磷平均浓度为0.031mg/L川;溶解氧为6.61mg/L,BOD为2.07mg/L,透明度1.77m,卡森修正指数为44.45(数据来源:大理白族自治州环境监测站);2009年,洱海沉积物总氮平均值为3310.88mg/kg、总磷平均值为930.53mg/kg。曾在1996年、1998年和2007年暴发大面积水华。2材料与方法2.1样品来源洱海海舌位于喜州湾附近(见图1),该湾水生植物非常茂盛,原来季节性有植物。采样船只为中国环境科学研究院洱海基地调查船,用自制表层采样器采集表层沉积物,装人灭菌过的离心管中,再放人冰盒中带回实验室。7925ǎ。à缘习竹2.2培养基2.2.1反稍化培养基硝酸钾29、硫酸镁0.29、磷酸氢钾0.59、酒石酸钾钠209、蒸馏水1000mL。pH约为7.2。2.2.2LB培养基胰蛋白陈109、酵母抽提物59、氯化钠109、蒸馏水I000mL,pH约为7.2。下关镇100.2东经(o)2.3反硝化细菌的筛选图1采样地点的分布2.3.1富集将采集的土样19加人到100mL的反硝化培养基中进行富集培养,30℃恒温静置密闭培养48h。待培养液变浑浊后,将富集培养液以涂抹平板法接种于反硝化固体培养基上,30℃恒温静置密闭培养48h。2.3.2分离纯化直至生长出单菌落,根据大小、形状等特征挑选单个菌落以分区划线法接种于LB培养基,30℃恒温静置密闭培养;用1」3培养基多次划线纯化,直到长出单个菌落为止,即得到纯化后的菌株,保存于1」3培养基斜面试管上,以备后续试验使用。2.4生理生化特性鉴定参考《伯杰细菌鉴定手册》和《微生物学实验》,选取接触酶(过氧化氢酶)试验、产硫化氢试验、葡萄糖氧化发酵试验、淀粉水解和产脂酶(Tween80)试验等五个实验。2.516SrDNA基因序列测定(1)分子鉴定参照文献困的方法提取总DNA,采用lFaCu568一584:5仁ATCATGGT(C/G)CTGCCGCG一3`,R3Cu1021一1040:5仁GCCTCGATCAG(A/G)TTGTGGTT一3`目的片段大小为473bp,扩增其部分16SrDNA序列。(2)PCR反应体系(50川)的组成:10又PCRBuffer,5拜L;dNTP,1拜L;DNA模板,1拜L;正反向引物(10拜mol)各3拜L;Ta叨NA聚合酶(SU/mL),0.5拜L;超纯水36.5拜L。(3)PCR反应条件:95℃预变性5min;94℃,305;57℃,305;72℃,305,1min;进行30个循·323·首届中国湖泊论坛论文集8670mg/kg,总磷为3460mg/k妙剑)。较高的氮磷含量,使洱海沉积物具有较大的释放风险,而洱海水体却保持较好。由于沉积物中存在大量反硝化细菌,并且这些细菌具有较强的反硝化能力,细菌通过反硝化作用,将沉积物中大量氮元素转化为气体(N:,NZO)逸散出来水体,降低了沉积物对洱海上覆水中氮含量的贡献,从而使洱海上覆水保持较好。作为反硝化作用的主体,研究洱海沉积物中反硝化细菌可为后期治理洱海及预测洱海水体变化提供重要信息。参考文献「1口沈国英,施并章.海洋生态学「M口.北京:科学出版社,2003:292一29.5「2口丁爱中,傅家漠,盛国英.好氧生物反硝化反应的实验证据「J口.科学通报,2000,45(3):2779一2782.「3口大理苍山洱海国家级自然保护区管理处.大理苍山洱海国家级自然保护区总体规划(1996一2010)「R口,2003.「4口大理市城乡建设环境保护局.洱海水污染防治规划(1996一2010)「R口.199.7「5口郑国强,于兴修,江南,等.洱海水质的演变过程及趋势「J口.东北林业大学学报,2004,32(1):99一102.「6口董云仙,李杰君,左永福,等.洱海水环境现状与治理对策「J口.云南环境科学,2004,23:101一103.「7口杨晓雪.洱海总磷、总氮污染现状分析「J口.云南环境科学,2006,25:113一11.5[8口SambrookJ,Russell.DMoleeularelonlng:alaboratorymanual[M口.3rded.NewYork:ColdSprlngHarborLa-boratoryPress,2001:27一30.「9口沈耀良,王成国.高浓度含氨废水的厌氧脱氮研究进展「J口.中国给水排水,2002,18:26一2.9[10口PatureauD,ZumstelnE,DeigeneSJP,etal.Aerobledenltrlfleatlonlsolatlonfromdlversenaturalandmanagedeeosystems[J口.MlerobEeol,2000,39:145一152.[11口ChenF,XlaQ,JuLK.AerobledenltrlfleatlonofPseudomonaSaeruglnosamonltoredbyonllneNAD(P)Hfluores-eenee[J口.Applled乙Evnlro~entalMleroblology,2003,69(11):6715一6722.「12口张光亚,方柏山,阂航,等一株好氧反硝化菌的特征及系统进化分析「J口.华侨大学学报,2004,25(1):75一78.「13口王圣瑞,焦立新,金相灿,等.长江中下游浅水湖泊沉积物总氮、可交换态氮与固定态铰的赋存特征「J口.环境科学学报,2008,28(1):37一43.「1妇孟凡德,姜霞,金相灿.长江中下游湖泊沉积物理化性质研究「J口.环境科学研究,2004,17:24一2.9「15口高丽,杨浩,周健民,等.滇池水体和沉积物中营养盐的分布特征「J口.环境科学研究,2004,17(封:1一.4·325·