二十多管发酵法粪大肠菌群指标检测规程

二十、多管发酵法粪大肠菌群指标检测规程1定义、原理及注意事项1.1定义粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便。在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖产酸气的大肠菌称为粪大便菌群。1.2方法原理用提高培养温度的方法，造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。1.3注意事项：1.3.1对化验室内部的质量控制1.3.1.1对化验室的要求①细菌监测化验室要求通风良好，又能避免尘埃、过堂风和温度骤变，并保持室内空气高度清洁和化验室用具的整洁。②化验室空间要合理利用，有专供培养基制备和灭菌以及玻璃器皿和其他器具消毒灭菌用的准备室和供应室，还要有供分装和制备无菌培养基、转移微生物培养的灭菌接种室。③化验室内墙壁要刷漆覆盖，地板要使光滑和防透水材料，以便刷洗和消毒。④化验室工作台应足够宽敞、高度适宜，台面应使用光滑、防透水、惰性的、抗腐蚀的、具有最少接缝的表面材料，室内照明要求均匀宜人。1.3.1.2化验室业务负责人的要求应定期和不定期地对化验人员进行化验室基本操作和各项专业技术训练，应掌握样品的采集和存放、培养基和玻璃皿的准备、灭菌过程、实验步骤、细菌技术、数据处理、质量控制等方面，及时排除各类问题提高化验室工作成效。1.3.1.3化验室器材、设备的校验①温度计或温度记录仪器：每年至少校准一次，对培养箱、冰箱、恒温水浴所使用的温度计，应按国家标准校验，并将温度监测数据登记造册。②天平：需使用最大载荷100g、感量为0.1g的药物天平和最大载荷10g、感量为0.1mg的分析天平。需保持天平和载物盘的清洁，砝码应参照标准砝码定期校核。③pH计：测定培养液的pH时，至少应精确到0.1pH单位，使用时至少用两种标准缓冲液进行校准，并标注第一次起用标准缓冲液日期，必要时应作温度校准。pH标准溶液的制备见表一。表一pH标准溶液的制备标准物质pH（25℃）每1000ml水溶液所含试剂的质量（25℃）基本标准酒石酸氢钾（25℃饱和）3.5576.4gKHC4H4O6a柠檬酸二氢钾3.77611.41gKH2C6H5O7邻苯二甲酸氢钾4.00810.12gKHC8H4O4磷酸二氢钾+磷酸氢二钾6.8653.388gKH2PO4b+3.533gNa2HPO4(b,c)磷酸二氢钾+磷酸氢二钾8.4131.179gKH2PO4b+4.302gNa2HPO4(b,c)四硼酸那9.1803.80gNa2B4O7.10H2Oc碳酸氢钠+碳酸钠10.0122.92gNaHCO3+2.64gNa2CO3辅助标准二水合四草酸钾1.67912.61gKH3C4O8.2H2Od氢氧化钙（25℃饱和）12.4541.5gCa(OH)2aa、近似溶解度。b、在100℃-130℃烘干2小时。c、用新煮沸过并冷却的无二氧化碳水。d、别名草酸三氢钾，使用前在（54±3）℃干燥，烘干温度不可超过60℃。注：用新煮沸冷却后蒸馏水配制（无二氧化碳）。④电热干燥箱：应有足够的空间，能提供均匀适当的170℃±10℃的灭菌温度，应配备160～180℃范围内能准确显示的温度计或温度记录装置，每日必须进行温度的稳定性校验。⑤高压蒸气灭菌器：每次使用时候，要在压力上升之前，必须先用蒸气将器内的冷空气完全驱尽，要记录温度、气压和灭菌的时间。应能提供均匀的高达121℃的高压灭菌温度，每月可用芽孢试条和芽孢悬浮液或特制的热变色滤纸条检查灭菌效果。⑥冰箱：箱内存放物品须标明名称、日期，每天检查和记录冰箱温度，每月清洁和消毒冰箱一次，至少每季清除一次存放过久无用物品。⑦紫外灯灭菌：每月用浸有乙醇的湿布擦拭一次，每季用紫外光度计测量紫外灯光2min，99%的菌数被杀死，否则，即应更换新灯。强度不少于初始值的70%或用生长有200～250个细菌菌落的琼脂平皿暴露于紫外灯下。⑧恒温培养箱：须每天检查二次，记录培养架上使用区的温度是否准确和稳定，温度变化不可超过±0.5℃。⑨恒温水浴箱：须每天检查和记录箱内温度，箱内存水应至少两周更换一次，并注意洗刷箱内沉积物。⑩显微镜：应按操作方法使用，使用后用擦镜纸清洁光学玻璃部分和载物台，并罩好套子。1.3.1.4化验室供应品的质量控制①玻璃器皿：包括培养皿、吸管、量管、稀释瓶、试管、发酵管等均应是硼硅玻璃制品，必须洁净不附着任何残渍，应剔除已破损、有划痕或有气泡的器皿。用于标准平皿计数的培养皿直径为90～100mm；用于滤膜技术的应使用60mm×15mm的培养皿，底部要求平整光滑。所有吸管的上端要用少量普通棉花填塞，注意松紧适度，使其快速、准确流出所需体积，试液每批校准误差不可超过2.5%，发酵试管应视水样量确定，一般取10ml水样时，试管为200mm×25mm；水样量为1ml时，试管为150mm×15mm，在用于监测产酸产气情况时，要在试管内装35mm×6mm的小套管，封闭端水不得漏气。②纯水质量：细菌监测化验室用水的原料水应当是蒸馏水或纯水。③试剂：必须使用纯度合格的试剂，以免试剂中不纯物资抑制或促进细菌的生长。购入或启用试剂要标明日期，配制好的试液要标明名称、浓度、配制人及配制日期，对任何系列培养试验或生化试验，要同时做阳性和阴性的对照培养。④染料和着色剂：用于细菌监测的燃料或着色剂，要求具有适当的强度和稳定性，常用的商品染料，往往因货品批号不同，其含量、组分及所含的不溶物和惰性材料均有所不同，因此在染色前，宜先对至少一种阴性和阳性的对照培养试行染色，并记录结果。⑤培养基：a.每批培养基在使用前，需经无菌监测。可将培养基置37℃温箱内培养24h后，证明无菌，同时再用已知菌种检查在此培养基上生长繁殖情况，符合要求后方可使用。标准菌株的观察指标见表二。表二标准菌株的观察指标培养基细菌类别发育观察指标乳糖蛋白胨培养液大肠杆菌+产酸产气产碱杆菌-b.对每批培养基，要做阳性和阴性的对照培养检查试验，对照培养实例见表三。表三微生物监测的对照培养细菌类别对照培养阳性阴性粪大肠菌类大肠埃希氏菌产气肠杆菌粪链球菌c.配制每批培养基均要作好笔录，登记配制日期，批次，培养基名称、成分、pH、灭菌条件、配制方法及配制人等。配制好的培养基，不宜存放过久，以少量配制为宜，可参照表四所列的存放时间内能用完的量来制备培养基。表四配制好的培养基的保存时间培养基保存时间在螺盖瓶中的膜滤液态培养基，存放与4℃96h在紧皿盖的平皿内的膜滤琼脂培养基，存放于4℃2星期在松帽试管内的琼脂或液态培养基，存放于4℃1星期在紧帽试管内的琼脂或液态培养基，存放于4℃3个月倒入松皿盖的平皿内的琼脂培养基，放入塑料袋中，封好。存放于4℃2星期在盖紧螺盖的大瓶中的大量琼脂培养基，存放于4℃3个月1.3.2玻璃皿的洗涤和灭菌1.3.2.1玻璃皿的洗涤①新购置的玻璃器皿，因含游离碱，应先在2%盐酸中浸泡数小时，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1～2次并沥干。②培养细菌的玻璃器皿，应先经高压蒸气灭菌，趁热倒出培养基，用热肥皂水或洗涤剂刷洗残渍，再用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1～2次，沥干。③洗涤吸管时，可先置3%来苏液内浸泡30min或高压蒸气灭菌，再用洗涤剂洗涤，用清水及蒸馏水冲洗干净。④洗涤染色瓶时，可在5%漂白粉液中浸泡24h后，再按常规方法洗涤干净。⑤含油脂的玻璃皿，应单独高压灭菌洗涤，趁热倒出污物，置100℃干燥箱烘烤0.5h，再放入5%碳酸氢钠水中煮沸，先去脂再行常规洗涤。新购置的洗涤液，可能因含有抑制或促进细菌生长的化学物质而影响洗涤质量，需进行洗涤效果的检查。1.3.2.2玻璃器皿的灭菌（1）干热灭菌化验室中常用的还有热空气灭菌的方法，即将洗净干燥的待灭菌器皿均匀放入恒温于干燥箱内，但不得与内层底板直接接触。关闭箱门，开启电源开关，用恒温调节器，使温度上升至160～170℃，维持2h，即可达到灭菌的目的。灭菌完毕后，需关闭电源，待温度降至50℃以下时，方可开门取物，否则玻璃器皿可因骤冷而爆裂。（2）高压蒸汽灭菌这是应用最广的灭菌方法，灭菌是用高压蒸汽灭菌锅进行。手提式高压蒸汽灭菌器，使用方便，适用于一般细菌监测化验室使用。其操作方法及注意事项如下：①打开锅盖或从加水口处向锅内加入适量的水。②加水后，将待灭菌器皿放入锅内，不要塞得过紧，以使锅内温度均匀，再将锅盖盖好，拧紧螺旋，使其密闭。③打开放气阀，打开热源加热至水沸腾，让锅内冷空气充分溢出。否则锅内温度达不到压力表所指示的对应温度，灭菌不彻底。当冷空气由排气孔排尽后，再关紧放气活塞。等锅内蒸汽压上升至所需压力时，控制热源，维持所需时间，一般为0.10343Mpa（121℃）表压，保持20min。④灭菌完毕，关闭热源，必须待压力自然降至“0”时，方可启盖取出灭菌物品，否则易发生危险。2试剂2.1培养基①单倍和三倍乳糖蛋白胨培养液：乳糖蛋白胨培养液蛋白胨10g牛肉浸膏3g乳糖5g氯化纳5g1．6%溴甲酚紫乙酵溶液1ml蒸馏水1000ml蛋白胨10g将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化纳加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙酵溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。此培养基适用于监测大肠菌群时作发酵试验之用。根据实际需要，也可按上述配方比例（除蒸馏水外）配成二倍、三倍或五倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。2.2EC培养液：胰胨20g乳糖5g胆盐三号1.5g磷酸氢二钾4g磷酸二氢钾1.5g氯化钠5g蒸馏水1000ml将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。置高压蒸气灭菌器中，115℃灭菌20min。灭菌后pH应为6.9。3仪器3.1冰箱3.2恒温培养箱（能够提供44.5℃±0.5℃灭菌温度）3.3电热干燥箱（能够提供均匀适当的170℃±10℃灭菌温度）3.4高压蒸汽灭菌器（能够提供均匀的高达121℃高压灭菌温度）3.5紫外灭菌灯3.6恒温水浴箱3.7显微镜3.8PH计3.9天平4水样的采样和保存采集的样品应尽可能地代表所采的环境水体特征，应采取一切预防措施尽力保证从采样到化验室分析这段时间间隔里不受污染和水样成分不发生任何变化。4.1采样4.1.1采水容器①采样瓶：通常采用以耐用玻璃制成的，带螺旋帽或磨口玻塞的500ml广口瓶，也可用适当大小、广口的聚乙烯塑料瓶或聚丙烯耐热塑料瓶。要求在灭菌的样品存放期间，该材料不应产生和释放出抑制细菌生存能力和或促进繁殖的化学物质。螺旋帽必须配以氯丁橡胶衬垫。②采样瓶的洗涤：一般可用加入洗涤剂的热水洗刷采样瓶，用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1～2次。新的采样瓶必须彻底清洗，先用水和洗涤剂清洁尘埃和包装物质，再用铬酸和硫酸洗液洗涤，然后用稀硝酸洗涤液洗涤，然后用稀硝酸溶液冲洗，以除去任何一重金属或铬酸盐的残留物，最后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水淋洗。对于聚乙烯容器，可先用约1mol/l盐酸溶液清洗，再依次用稀硝酸液浸泡，蒸馏水冲洗干净。③采样瓶的灭菌：将洗涤干净的采样瓶盖好瓶塞（盖），用牛皮纸等防潮纸将瓶塞、瓶顶和瓶颈处包裹好，置干燥箱160～170℃干热灭菌2h，或用高压蒸气灭菌器，121℃经15min灭菌。不能使用加热灭菌的塑料瓶则应浸泡在0.5%的过氧乙酸溶液中10min或用环氧乙烷气体进行低温灭菌。聚丙烯耐热塑料瓶，可用121℃高压蒸气灭菌15min。4.1.2去氯水样的采集采集加氯处理的水样时，余氯的存在会影响待测水样在采集时所指示的真正细菌含量，因此须经去氯处理。可在洗涤干净的样品瓶内，于灭菌前按500ml采样瓶加入0.3ml10%Na2S2O3。当被测水样含有高浓度重金属时，则须在采样瓶内，于灭菌前加入螯合剂以减少金属毒性，采用点位置较远，须长距离运输的这类水样更为重要。可按500ml采样瓶加入1ml15%的乙二胺四乙酸二钠盐溶液。4.1.3采样步骤及注意事项①已灭菌和封包好的采样瓶，无论在什么条件下采样时，均要小心开启包装纸和瓶盖，避免瓶盖及瓶子颈部受污染，并注意在使用船只或附带的采样缆绳等附加