二氧化碳背压对啤酒生成高级醇和酯的影响杨东升

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酿酒科技2019年第2期(总第296期)·LIQUOR-MAKINGSCIENCE&TECHNOLOGY2019No.2(Tol.296)DOI:10.13746/j.njkj.2018239基金项目:海南省科技厅科研基金(317006)。收稿日期:2018-08-01作者简介:杨东升(1966-),男,本科,高级工程师,主要从事生物化工研究工作。优先数字出版时间:2018-10-24;地址:。杨东升,李静,苏敏,李佳伟(海南大学材料与化工学院生物工程系,海南海口570228)摘要:在啤酒工业中研究了CO2背压作为改善啤酒质量的方法。本研究通过对不同浓度麦汁施以不同CO2背压发酵,测定在主发酵过程中不同的理化参数,研究了CO2背压和麦汁浓度对啤酒生成高级醇和酯含量的影响。对高级醇和酯生成速率的研究揭示了CO2背压对其生成延迟变化的规律。结果表明,CO2背压可以增加啤酒醇/酯比,影响和平衡啤酒风味,特别是对较高浓度麦汁啤酒的影响较大。关键词:啤酒;二氧化碳;背压;高级醇;酯中图分类号:TS262.5;TS261.4文献标识码:A文章编号:1001-9286(2019)02-0024-06EffectsofCO2BackPressureontheYieldofHigherAlcoholsandEstersinBeerYANGDongsheng,LIJing,SUMinandLIJiawei(SchoolofMaterialsandChemicalEngineering,HainanUniversity,Haikou,Hainan570228,China)Abstract:CO2backpressureisappliedinbreweriestoimprovebeerquality.Inthisstudy,differentCO2backpressurefermentationwasperformedinwortofdifferentconcentrations,thephysiochemicalindexesweremeasuredinchieffermentingprocess,andtheef-fectsofCO2backpressure/wortconcentrationontheyieldofhigheralcoholsandestersinbeerwasexplored,thentherulesinCO2backpressuredelayingtheyieldofesterswererevealedthroughtheanalysisoftherelationsbetweenhigheralcoholsandestersyieldratio.Theresultssuggestedthat,CO2backpressurecouldincreasetheratioofhigheralcoholstoestersinbeerandfurtherinfluenceandbalancebeerflavorandtaste,especially,CO2backpressurehadstrongerinfluenceonwortofhigherconcentrations.Keywords:beer;CO2;backpressure;higheralcohols;esters众所周之,啤酒的风味和香气对决定其质量至关重要,同时这些参数受到二氧化碳压力的影响[1-2]。一般认为,影响风味化合物产生的最直接因素是溶解二氧化碳,其浓度取决于所施加的温度和背压。另一方面,随着市场需求的增加,啤酒厂不断增大啤酒生产的反应器尺寸。巨大的发酵罐自然产生更高的静水压力,通常会增加溶解在啤酒中的二氧化碳浓度。在许多生物体中,包括酵母菌,高二氧化碳分压对其生长有抑制作用[3-4]。啤酒中所有风味活性成分都是由酵母产生的,这些化合物最终将决定啤酒的最终质量[5]。高级醇、酯类、乙醛、二甲基硫醚(DMS)和二氧化硫等是啤酒风味的关键元素。啤酒酵母产生的高级醇是啤酒中最丰富的感官成分。高级醇的形成与酵母代谢氨基酸有关。这些化合物的产生可以通过两个途径发生。第一是埃利希提出的分解代谢途径[6],第二是氨基酸合成途径[7]。正丙醇、异丁醇和异戊醇是啤酒中最重要的高级醇。异戊醇的气味阈值范围为25mg/L,正丙醇为50mg/L[8]。即使某些高级醇或酯的实际浓度低于它们的阈值,但其存在对于整体风味分布也很重要[9]。啤酒中的高级醇既是风味活性化合2424物,又是与酰基辅酶A衍生物反应生成酯的底物。有众多的因素影响高级醇的形成,其中有酵母菌种、发酵温度、酵母接种量、麦汁组成、麦汁通氧等[10]。高级醇的形成不仅会随着较低的接种温度和发酵温度而减少,也会随着CO2压力的作用而降低[7,11]。有研究表明,较高的温度增加了发酵速率和高级醇的产率和最终浓度,而不依赖于施加的背压。然而,高级醇的浓度取决于CO2浓度[1]。挥发性酯类是啤酒中风味物质的最大组分。酯类在啤酒中含量仅为痕量,但它们对风味谱极为重要。啤酒中的挥发性酯类可分为乙酸酯类和中链脂肪酸(MCFA)乙酯两大类。乙酸酯是啤酒的主要风味成分,因为它们的浓度远高于其他挥发性酯[5]。啤酒中最重要的酯类是乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸异丁酯和乙酸苯酯。乙酸乙酯的形成不受氮源影响,使其成为浓度最高的酯[12]。酯类气味阈值较低,乙酸异戊酯为0.2mg/L,乙酸乙酯为15~20mg/L[13-14]。酯在酵母中通过乙醇或高级醇、酰基辅酶A(主要是乙酰辅酶A)和酯合成酶的生化途径合成。方差分析证实,溶解CO2浓度对最大生长速率、最大和初始酯产率有显著的负面影响,并且这种效应比温度效应更明显[1]。在正常的啤酒发酵中,发酵温度越高,发酵副产物越多。一种补救办法是采用CO2的发酵罐背压。CO2压力升高,导致高级醇和酯的浓度降低,而邻位二酮和乙醛的含量增加[15]。最大的酵母生长速率和酯产率与超过2g/L溶解CO2浓度呈显著负相关[1]。研究表明,凡是有利于酵母旺盛发酵的工艺条件,都有利于酯类的形成[16],相反,酯和高级醇的形成随着二氧化碳压力增大而减少,却主要是由于酵母生长的减少。然而,CO2对高级醇形成的影响比对酯形成的影响要小[3]。另一方面,酯类的产生与麦汁浓度有关,而高浓度麦汁中的酵母产生更多的乙酸酯类。这导致了啤酒风味的不平衡,是由产生的挥发性化合物的不成比例的水平引起的[17-18]。这也可称之为醇酯比失衡,研究证明,通过发酵醇酯比的合理控制,可以有效地控制啤酒风味质量的一致性和均一性[19]。1材料与方法1.1材料原料:啤酒大麦、啤酒花购自济南双麦有限公司;啤酒酵母SaccharomycescerevisiaeNCYC1108由海南大学生物综合实验室保存。试剂:正丙醇、异丁醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯,GR,阿拉丁试剂(上海)有限公司。仪器设备:顶空气相色谱HP6890N,细胞计数板。1.2实验方法麦汁制备:分别取20kg和25kg大麦芽粉碎,入100L糖化锅,加水80L,按45℃保温15min,52℃保温20min,63℃保温30min,72℃保温20min,再加热至78℃进行浸出糖化。麦汁过滤液合并加水55L,二次过滤液(洗糟)煮沸70min,煮沸10min时和煮沸40min时各加50g酒花。冷却,分别制得8°P麦汁和12°P麦汁各100L[20]。发酵条件:每个实验使用100L的两种浓度的麦芽汁(8°P和12°P),麦芽汁充氧直到接种前饱和。发酵罐的排气阀在接种后关闭,以产生背压。在整个发酵过程中,压力传感器控制背压分别保持在0、0.05MPa和0.15MPa,发酵在10℃下进行。每20h取样品,测定细胞数、麦汁密度和溶解CO2、总高级醇含量和总酯浓度。共测量10d。酵母活化:啤酒酵母菌株经复苏、琼脂平板划线挑取单菌落、接入20mL麦汁培养基,25℃培养2d。酵母加入装有经灭菌的1.5L8°P麦汁的3L锥形烧瓶中,用滤膜密封烧瓶,20℃轨道振荡扩培3d。接种前2h发酵温度降至10℃。高级醇和酯的检测:采用顶空气相色谱HP6890N(FID检测器)测定正丙醇、异丁醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯。采用毛细管HP-NIONAX柱(30m×0.32mm×0.25μm膜厚)和顶空采样器HP7694E。实验条件如下:注入温度为225℃;柱温程序,在40℃下保持3min,然后以5℃/min升温到90℃;检测器温度,300℃;载气,氮气;载气流量,30mL/min;氢气流量,40mL/min;杨东升,李静,苏敏,李佳伟·二氧化碳背压对啤酒生成高级醇和酯的影响2525酿酒科技2019年第2期(总第296期)·LIQUOR-MAKINGSCIENCE&TECHNOLOGY2019No.2(Tol.296)空气流量,400mL/min;分流比,6∶1;样品瓶平衡温度50℃;平衡时间,30min;循环温度,60℃;传输线温度,65℃。工作站软件PG2070AA[21-22]。使用细胞计数板测定细胞数;溶解的CO2使用电位滴定仪测定;麦芽汁浓度采用锤度法测定[20,23]。2结果与分析2.1CO2背压对CO2浓度、酵母数量、总高级醇和酯的影响发酵方法如1.2部分所述,CO2背压对基本发酵特性的影响见图1—图8。结果表明,施加0.05MPa和0.15MPa的CO2背压显著减缓了酵母生长,降低了总高级醇的最终浓度和总酯生成,增大了溶解CO2的最终浓度。麦汁浓度并未明显影响CO2的增长趋势,这可能与CO2浓度达到饱和有关。主发酵前期,CO2压抑制酵母生长,生成CO2数量较少,主发酵后期,在发酵温度一致的情况下,CO2积累达到一定水平,压力越大,浓度越高(图1)。在本实验中,通过增大背压来减少酵母细胞生长。由图2可见,在主发酵前期,细胞生长曲线只是依照背压水平分组,麦汁浓度的影响不大。不仅最大细胞计数减少了45%,而且达到最大值的时间延长了40~60h(图2),同一酵母,较低发酵温度或较高CO2背压可以控制最大酵母数量。在实际生产中,采用背压工艺时可以选择性状优良的酵母作为生产菌株,以消除CO2对其生长代谢的影响。研究表明,细胞数量的减少导致较低的醇和酯浓度降低[24]。类似地,随着研究中细胞数量的减少,总醇含量和总酯含量下降。另一方面,总高级醇和总酯的最终水平不仅取决于CO2背压,也取决于麦汁浓度。12°P麦汁中总高级醇和总酯含量高于8°P麦汁(图1)。虽然目前8°P啤酒市场在美国市场占有率很高,但这种啤酒在欧洲市场仍然不被接受,因为淡啤酒被认为是清淡型的,主要是因为缺乏口感[25]。图3显示,在无背压情况下,8°P和12°P麦汁中总高级醇含量均在75h时达到最高值。在0.05MPa和0.15MPa背压情况下,8°P麦汁中总高级醇含量均在120h达到最高值,分别约为无背压最高值的50%和45%,12°P麦汁中总高级醇含量均在200h达到最高值,分别约为无背压最高值的70%和60%。由此可见,麦汁浓度控制高级醇的累加效应,CO2背压控制总高级醇最终生成量,控制效果是非常明显的。注:所有实验均在10℃下进行,A0=8°P,0MPa;A1=8°P,0.05MPa;A2=8°P,0.15MPa;B0=12°P,0MPa;B1=12°P,0.05MPa;B2=12°P,0.15MPa。以下所有图同。图1CO2浓度变化图图2酵母数量变化图图3总高级醇含量变化图2626主酵时常压发酵,双乙酰还原结束再升压,乙醛含量较低,酯含量较高[26]。这是一种提高酯含量的工艺方案。而提早升压,结果是相反的。图4显示,在无背压情况下,8°P和12°P麦汁中总酯含量均在100h达到最高值。在0.05MPa背压情况下,8°P和12°P麦汁中总酯含量分别在160h和180h达到最高值,分别约为无

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