发光菌法测定医疗机构废水生物毒性

书书书第３８卷　第２期２０１７年　３月计　　　量　　　学　　　报ＡＣＴＡ　ＭＥＴＲＯＬＯＧＩＣＡ　ＳＩＮＩＣＡ　Ｖｏｌ．３８，№２　Ｍａｒｃｈ，２０１７ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００１１５８．２０１７．０２．２５发光菌法测定医疗机构废水生物毒性李永亮１，　李　健１，　李桂莲２，　于亭亭３（１佳木斯市环境保护监测站，黑龙江佳木斯１５４００４；２黑龙江大学环境科学与工程系，黑龙江哈尔滨１５００８０；３齐齐哈尔大学应用化学系，黑龙江齐齐哈尔１６１００６）摘要：利用费舍尔弧菌为菌种，结合粪大肠菌群的测定，对医疗机构排放的废水进行综合测试。监测结果均符合相应的标准限值要求，但具有一定的生物毒性，对发光菌具有一定的生物抑制率。传染病和结核病医疗机构的废水生物抑制率最高，达４４７％和４９８％；中医医疗机构废水的抑制率最低，为８１％。实验结果表明，发光菌法可应用于医疗机构废水生物毒性的测定。关键词：计量学；废水监测；发光菌；生物毒性；抑制率；粪大肠菌群中图分类号：ＴＢ９９　　　　文献标识码：Ａ　　　　　文章编号：１０００１１５８（２０１７）０２０２３８０４ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｏｘｉｃｉｔｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓＷａｓｔｅＷａｔｅｒｂｙｔｈｅＭｅｔｈｏｄｏｆＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＢａｃｔｅｒｉａＬＩＹｏｎｇｌｉａｎｇ１，　ＬＩＪｉａｎ１，　ＬＩＧｕｉｌｉａｎ２，　ＹＵＴｉｎｇｔｉｎｇ３（１ＪｉａｍｕｓｉＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇＳｔａｔｉｏｎ，Ｊｉａｍｕｓｉ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１５４００４，Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１５００８０，Ｃｈｉｎａ；３ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｐｐｌｉｅｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＱｉｑｉｈａｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｑｉｈａｒ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１６１００６，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＶｉｂｒｉｏＦｉｓｃｈｅｒｉａｓｓｐａｗｎ，ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｔｅｓｔｏｆｔｈｅｗａｓｔｅｗａｔｅｒｄｉｓｃｈａｒｇｅｄｂｙｍｅｄｉｃａｌｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ，ｃｏｍｂｉｎｅｗｉｔｈｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｅｃａｌｃｏｌｉｆｏｒｍＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆｆｅｃａｌｆｌｏｒａｏｆｗａｓｔｅｗａｔｅｒｃｏｎｆｏｒｍｅｄｔｏｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｓｔａｎｄａｒｄｌｉｍｉｔ，ｂｕｔｍｅｄｉｃａｌｗａｓｔｅｗａｔｅｒｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｏｘｉｃｉｔｙｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｅｒｔａｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅｔｏｐｈｏｔｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｈｅｗａｓｔｅｗａｔｅｒｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｍｅｄｉｃａｌｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｐｏｓｓｅｓｓｅｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅｓａｓｈｉｇｈａｓ４４７％ａｎｄ４９８％ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｗａｓｔｅｗａｔｅｒｆｒｏｍｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｍｅｄｉｃａｌｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｃａｕｓｅｄａｍｉｎｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ８１％ＴｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｂａｃｔｅｒｉａｍｅｔｈｏｄｃｏｕｌｄｂｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｗａｓｔｅｗａｔｅｒｏｆｍｅｄｉｃａｌｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓＫｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ；ｗａｓｔｅｗａｔｅｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｂａｃｔｅｒｉａ；ｔｏｘｉｃｉｔｙ；ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅ；ｆｅｃａｌｃｏｌｉｆｏｒｍ收稿日期：２０１５１２０９；修回日期：２０１６０２０４作者简介：李永亮（１９８４－），男，黑龙江阿城人，佳木斯市环境保护监测站工程师，主要从事环境监测工作。Ｌｉｙｏｎｇｌｉａｎｇ１９８４０２＠１６３ｃｏｍ李健为本文通讯作者。[e-mail]１　引　言医疗机构废水不同于一般工业废水，其主要污染物为致病菌。致病菌的种类和数量因医院的规模和类型不同，如废水中含有粪大肠菌群、肠道致病菌、肠道病毒、结核杆菌及其它致病菌等。目前，医疗机构废水消毒主要采用直接投加消毒剂、使用二氧化氯和臭氧消毒等消毒方式。ＧＢ１８４６６—２００５《医疗机构水污染物排放标准》也只对粪大肠菌群、肠道致病菌、肠道致病毒、结核杆菌的含量进行了规定，并未对水质的生物毒性进行说明。我国环境领域测定水质生物毒性常用材料为斑马鱼和不同种类的发光细菌。常用的发光菌有进口的深海咸水型费舍尔弧菌和国产的淡水型青海弧菌［１～３］。利用发光菌法测定水质中的生物毒性主要是利用发光菌的生物发光特性。在正常水质中，发光菌的发光量具有一定的发光范围；当水质毒性较大时，发光菌的新陈代谢受到抑制，发光量显著下降，当毒性超过一定阈值，会出现发光量急剧下降或消失，发光菌出现死亡现象。因此，利用发光菌法测定医疗机构废水，能够真正反映出水质的生物毒性，对排放水质进行合理评价。２　实　验利用费舍尔弧菌测定医疗机构废水的生物毒性，同步测定粪大肠菌群。发光菌实验依据ＤＩＮＥＮＩＳＯ１１３４８－１：２００９《水的质量关于费氏弧菌发光水样的抑制作用的测定（发光细菌试验）第１部分：采用新制备细菌法》标准制定，根据加入废水前后发光菌的发光量变化对水质生物毒性进行评价［４～６］。２１　仪器及实验试剂在线生物毒性仪Ｔｏｘｃｏｎｔｒｏｌ：荷兰Ｍｉｃｒｏｌａｎ公司，附带菌种和培养液。氯化钠（使用液浓度为２００ｇ／Ｌ）、硫酸锌（使用液浓度为２５００ｍｇ／Ｌ）、硫代硫酸钠（使用液浓度为１０％）：天津科密欧化学试剂有限公司，分析纯。粪大肠菌群培养基（胰胨２０ｇ，乳糖５ｇ，胆盐三号１５ｇ，磷酸氢二钾４ｇ，磷酸二氢钾１５ｇ，氯化钠５ｇ，以上成分溶解，１１５℃灭菌时间为２０ｍｉｎ）：天津科密欧化学试剂有限公司，以上试剂均为相应纯度试剂。试剂配制用水为实验室内水机自制去离子水，空白对照实验所用参比水为未经消毒处理的地下水。２２　实验样品采集样品采集所用容器为经过１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ的细口瓶，在灭菌前按照５００ｍＬ采样瓶加入０３ｍＬ１０％的硫代硫酸钠溶液，消除使用含氯消毒剂消毒后残留的总余氯对粪大肠菌群和发光菌的影响，样品直接采集于细口瓶中，不可使用样品水荡洗。样品采集后，使用消毒橡胶布密封瓶口，避免杂菌的干扰。放入车载冰箱４℃保存，带回实验室内进行分析，采样与分析时间不大于２ｈ。样品分别采集自８家不同类别的医院，消毒方式一律采用二氧化氯消毒。２３　粪大肠菌群的测定采用多管发酵法，对水样进行接种，通过初发酵试验在（３７±０５）℃培养（２４±２）ｈ，检验其是否产酸或者产气，如不产酸或者产气，进行复发酵试验，在（４４５±０５）℃培养（２４±２）ｈ，观察是否产酸或者产气，产气则证实其为粪大肠菌群阳性，从ＭＰＮ表中查得相应的ＭＰＮ指数［７，８］。２４　生物毒性的测定２４１　适应温度测试生物毒性监测仪调整到正常工作状态，清洗进样管和进样针，更换注射器。菌种与营养液１１（个数比）混合后，放入菌种盛装杯。菌种盛装杯设置温控装置，调节温度为４℃，用于菌种的贮藏。测试时，仪器自动抽取适量菌种与盐水混合，混合后默认温度恢复时间为５ｍｉｎ，悬浮液温度调整范围为（２０±０５）℃，在此温度下，菌种具有较好的活性和较高的发光强度。此时，抽取混合液进入注射器系统，设Ｔ０为零时刻，测定Ｔ０时的发光强度ＬＲＴ０，由光电倍增管读取。２４２　参比水测试仪器将发光菌使用液吸取后，注入到参比水（未经处理地下水）中，读取发光菌悬浮液与参考水样的发光量，记为ＬＲＴ。２４３　测量Ｔ１时间后发光量混合时间Ｔ１到后，测定最终发光量。ＬＲＴ１为参考水样发光量，ＬＳＴ１为实际水样发光量。设置混合时间为１５ｍｉｎ，温度恢复到（２０±０５）℃。２４４　判定修正系数和抑制作用以ＬＲＴ０的测量和ＬＲＴ１确定发光强度的变化过程和相关参数。在相同条件下，发光强度的自然变化对于参考水样（相当于空白和水样）和水样是同等的，发光强度的变化是在一定范围内的。因此，使用修正系数来修正在一定时间内发光强度的自然漂移范围。参考水样发光强度在一定时间内发生变化时，用于修正的修正系数（ＣＦ）在程序内可自动计算。修正系数为：ＣＦＲＴ１＝ＬＲＴ１／ＬＲＴ０式中：ＣＦＲＴ１为Ｔ１时刻参考水样修正系数；ＬＲＴ１为１５ｍｉｎ后即Ｔ１时刻参考水样发光量；ＬＲＴ０为开始５ｍｉｎ即Ｔ０时刻参考水样发光量；因此发光强度可修正为：ＬＲＴ１＝ＬＳＴ０·ＣＦＲＴ１　　抑制光强度：ＬＴ１＝（（ＬＲＴ１－ＬＳＴ１）／ＬＲＴ１）·１００２４５　参比水毒性测试以未处理过的地下水为参比水，按照操作规程，重复测定６次，计算修正系数ＣＦ值和抑制率。２４６　标准毒物测试以２５００ｍｇ／Ｌ硫酸锌为标准毒物，使用盐水稀释。按照设定参数自动混合稀释后浓度为２０ｍｇ／Ｌ，测定６次，计算ＣＦ值、抑制率和精密度，评价仪９３２第３８卷　第２期李永亮等：发光菌法测定医疗机构废水生物毒性器稳定性。２４７　菌种稳定性测试由于温度对菌种的活性有重要影响，因此，在菌种使用时必须考察菌种的稳定性。用同一浓度的标准毒物对菌种的稳定性进行测试，连续２天，每天测定３次。计算测量结果的极差和相对标准偏差，用于评定菌种的稳定性。仍使用２０ｍｇ／Ｌ的硫酸锌标准溶液作为标准毒物，对菌种的稳定性进行考察。２４８　实际水样测试采集后的样品，去除残余的总氯后，测定水样的ＣＦ值、抑制率（％）、Ｔ０时刻发光量ＬＳＴ０、测定时长Ｔ１时刻发光量ＬＳＴ１，结合粪大肠菌群监测结果，评价水质的生物毒性。３　结　果３１　参比水毒性测试结果参比水毒性测试结果见表１。参比水对菌种发光量的生物抑制率均在≤±２％范围内，符合相关规定要求，可作为日常参比水使用。表１纯水毒性指标测试测定次数ＣＦ抑制率／（％）抑制率评价标准１１．２６－１．１０２１．０７－１．００３１．２３－１．０４４１．２０－１．３０５１．１８－１．８５６１．０３－１．７４≤±２％（仪器使用手册和ＤＩＮＥＮＩＳＯ１１３４８－１：２００９标准中参比水要求）３２　标准毒物测试结果标准毒物测定及统计结果见表２。表２标准毒物测定及统计结果（％）测定次数１２３４５６均值ＣＦ１０１０９８１０１１００１１９１２６１０８抑制率６４１６８７６５６７２５６７９６９３６８０相对误差３９０７－２４４５－０１１３相对标准偏差－３９～４５　　生物抑制率大于仪器使用说明和ＤＩＮＥＮＩＳＯ１１３４８－１：２００９中规定的抑制率均大于２０％的实验要求，且相对误差均小于１０％，６次重复性测量的相对标准偏差均小于５％，说明２０ｍｇ／Ｌ的硫酸锌标准溶液对菌种活性具有明显的生物抑制作用，使菌种的发光量显著减小。因此，２０ｍｇ／Ｌ的硫酸锌标准溶液可作为日常测试中的参考标准毒物，用于判定ＣＦ值的变化范围和仪器的准确度是否在规定的范围内。３３　菌种稳定性测试结果菌种稳定性测试结果见表３。第１天和第２天测量结果的标准偏差分别为３５５％和３４７％；标准毒物２０ｍｇ／Ｌ硫酸锌标准毒物的抑制率测试结果分别为６６１％和６９９％；每日测定抑制率的极差为４６％，２天测量抑制率的极差为８４％；分别小于仪器使用说明书中规定的相关规定标准偏差均小于１５％，抑制率在２０％～８０％之间，抑制率测量极差小于１０％的相关参数要求。测试结果表明，菌种在一定的时间范围内具有较好的稳定性，菌种的稳定性对实验的影响较小，可应用