反应器形式及污泥形态对厌氧氨氧化菌群落结构的影响

第!卷第期#$%年月中国科学院大学学报&’()*+,’-.*/01)2/34’-56/*12178+91:4’-;8/1*812’,=!&+*(+)4?’=!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!#$%国家自然科学基金!K$JCS#K$-中国科学院资环局专项!N##K$SF7#和中国科学院创新工程项目!X;5m#GNbGQG$K%G%资助D通信作者#FG:+/,$‘8,/(I(8+2=+8=8*文章编号!#$JKGL!%!#$%$G$$LCG$C反应器形式及污泥形态对厌氧氨氧化菌群落结构的影响徐亚慧!刘苗苗#!张树军!!张震南!李娟!刘新春D!中国科学院大学#北京$$$%J%#中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室#北京$$$SK%!北京城市排水集团有限公司#北京$$$##!#$!年%月C日收稿%#$!年K月##日收修改稿M37W#J-3KK#S+&)2!6#$*&,;@)&$%1-A&##)-3#GY-/&4-)21&A*$%-&A##3)-*.A#0(-*-)(-)/-$%$)*%$&A*%(&)/(,3/2$#%0+,2-$(&6’;63%)&,=)-$%(-*.?+-)$($@A&/$#.!A-$)A$(#BCDE#FD!D$U‘G‘F#dE;摘要通过构建克隆文库!对反应器类型和污泥形态对厌氧氨氧化#+*+::’‘$细菌的群落结构的影响进行探索=研究发现!反应器类型对+*+::’‘细菌群落结构影响不大!但其种泥来源对功能细菌的群落结构有一定影响=污泥形态对+*+::’‘细菌群落结构有着重要影响!絮体污泥中的+*+::’‘细菌以3(-5,5()L.L*-*-,(为主%聚集态污泥中的+*+::’‘细菌则以3(-5,5()L.61$(5,(为优势菌%在同时存在絮体污泥和生物膜的复合式反应器中!不同污泥形态中+*+::’‘细菌在接触时会发生迁移!但其优势菌种不发生变化=关键词厌氧氨氧化细菌%颗粒污泥%絮体污泥%生物膜污泥%M5RG5,’*1中图分类号!mC#文献标志码!7/-$iCK#!]H=/22*=#$JKGL!%=#$%=$=$@)&$%1-A&##)-3#GY-/&4-)21&A*$%-&A##3)-*.A#0(-*-)(-)/-$%$)*%$&A*%(&)/(,3/2$#%0+,2-$(m.N+6(/#^U.T/+’:/+’##fj7?Q;6(H(*!#fj7?Qf61**+*#^U&(+*#^U.m/*86(*!/-,0*1.,)2$&3#,-*.*4(5*+2$&!,*-*.#6*,7,-8$$$%J#3#,-(%#!)()**2J(K$1()$12$&^-0,1$-+*-)(%4OL(),3#*+,.)12#[*.*(1#3*-)*1&$1^$e^-0,1$-+*-)(%!,*-*.#3#,-*.*4(5*+2$&!,*-*.#6*,7,-8$$$SK#3#,-(%!6*,7,-8D1(,-(8*I1$LM3$BJ)5B#6*,7,-8$$$###3#,-(@1(*%&A*U*36/223(94#+,,3619’:/*+*3+*+::’‘A+831)/+V1)19/23)/A(319’01)3V’E1*1)+#3(-5,5()L.61$(5,(+*9L*-*-,(#/*-’()+*+::’‘)1+83’)2=U3V+226’V*36+32,(9E1:’)@6’,’E4@,+419+*/:@’)3+*3)’,1/*361A+831)/+,8’::(*/3423)(83()1’-+*+::’‘A+831)/+=T’)136+*!L@1)81*32’-+*+::’‘A+831)/+/*E)+*(,+)2,(9E1+*9A/’-/,:A1,’*E193’3(-5,5()L.61$(5,(#V6/,1/*-,’88(,1*32,(9E13619’:*/*+*3+*+:::’‘A+831)/+V+23(-5,5()L.L*-*-,(B7*+::’‘A+831)/+/*9/--1)1*32,(9E1:’)@6’,’E/12V’(,9:/E)+31/*3612+:1)1+83’)#A(33619’:/*+*32@18/12)1:+/*19=H$.I%/(+*+::’‘A+831)/+%E)+*(,+)%-,’88(,1*3%A/’-/,:%M5RG8,’*1中国科学院大学学报第!期水体中氨氮过剩是造成水体富营养化的重要原因之一#十二五期间#氨氮已经成为污染物总量控制的约束性指标=为降低氮污染物向收纳水体的排放#污水处理过程中氮素的去除越来越受到人们的重视=然而传统脱氮工艺流程较长#占地面积大#基建投资高&’#人们对于生物脱氮新工艺的研究从没有止步=#$世纪J$年代末#T(,91)等在运行反硝化流化床工艺时发现厌氧氨氧化现象&#’=此后这种现象引起很多科学家的兴趣=厌氧氨氧化反应是指在缺氧条件下#+*+::’‘细菌直接以?jg%作为电子供体#以?\Z#作为电子受体#将?jg%和?\Z#转化为?#的生物氧化过程&!’=以厌氧氨氧化过程为基础的自养脱氮工艺于#世纪初开发成功=厌氧氨氧化工艺具有曝气能耗低#不需要有机碳源#污泥产率低等优点&%GK’=7*+::’‘细菌是完成脱氮过程的关键#针对厌氧氨氧化菌的研究对反应器和种泥筛选-工艺启动和运行#以及运行稳定性评估等均有重要作用#因此针对厌氧氨氧化菌的研究受到了诸多关注&LG’=7*+::’‘细菌菌体呈球菌状#直径不足’:=基于L;)R?7基因的分析认为+*+::’‘细菌是浮霉菌门!?#2%L+?%(-)$+2*)(%*.分支进化而来的一类自养化能群体&J’=已报道的+*+::’‘细菌分属于K个属#分别是3(-5,5L)L.61$(5,(-3(-5,5()L.L*-*-,(-3(-5,5()L.!(%,-5L(-3(-5,5()L.4-(++$=$8%$KL.和3(-5,5()L.:*))*-,(=利用分子生物学方法对不同生态环境中+*+::’‘细菌进行观察和鉴定#发现同一生态系统中#+*+::’‘细菌会呈现出较弱的多样性#一种菌种可能倾向于一种单一的生存环境=3(-5,5L)L.61$(5,(-3(-5,5()L.L*-*-,(-3(-5,5()L.4-(++$=$8%$KL.倾向于在厌氧淡水等水体中生存&S#$G’#而某些海洋沉积污泥或低溶氧水体中主要的+*+::’‘细菌是3(-5,5()L.!(%,-5L(细菌&$##G%’=3(-5,5()L.L*-*-,(类细菌倾向存在于厌氧淡水水体中#且具有较强的盐碱耐受性&%’=不同生态环境中#+*+::’‘细菌会呈现不同的分布和多样性=在厌氧氨氧化脱氮处理系统中#反应器的形式和污泥形态会影响功能菌群的分布#但目前关于反应器类型以及污泥形态对+*+::’‘细菌分布机制的影响并不清楚#尚没有一致的结论=本研究以%个厌氧氨氧化反应器为研究对象#所选取的样品包括不同的反应器形式及污泥形态=反应器类型既有#段式的.7;c反应器#同时涵盖了一体化的5;PR反应器和UB7;反应器=反应器内污泥形态既有絮体污泥#又有颗粒污泥和生物膜#选取的研究对象有一定代表性=以此来研究功能菌群在不同反应器及不同污泥形态上的分布#对于深入了解+*+::’‘细菌不同生境下的分布机制#为厌氧氨氧化工艺的稳定运行提供技术支持具有重要意义=DQ试验材料和方法DVDQ反应器类型概述本研究基于%个不同的厌氧氨氧化反应器#如表所示=反应器7和c均采用#段上流式厌氧氨氧化工艺!.7;c#其进水和出水回流均利用水泵从底部进入反应器内#出水则通过固液气!相分离器分离后产出=反应器5是基于活性污泥G生物膜复合式设计的一体化厌氧氨氧化反应器!UB7;#以边长8:的立方体海绵作为微生物生长的载体=O反应器则是采用连续搅拌反应器系统!5;PR#曝气池和沉淀池在一个反应器中=%个反应器接种污泥均来自北京市政污水处理系统中的硝化污泥#O反应器中额外接种了厌氧氨氧化颗粒污泥和厌氧颗粒污泥=DVBQ样品采集及保存%个反应器污泥样品均在反应器稳定运行时采集#取反应器内混合均匀的污泥K$:^#并于Z#$ƒ冰箱内保存=5反应器填料上的生物膜利用灭菌后的_Mc;溶液!@j[J反复浸泡#直至填料上污泥全部洗脱掉#离心后取离心管底部污泥储存于Z#$ƒ冰箱内=DVFQ污泥形态表征污泥粒径分布采用马尔文#$$$粒径速测仪测定#污泥形态采用扫描电子显微镜!;G!$$$#日本日立测定=污泥颗粒用去离子水清洗数次后#用#iK€-@j值为LiS的戊二醛固定#再利用磷酸缓冲液冲洗#接着用乙醇脱水后使用乙醇和乙酸异戊酯置换#并在干燥器中至完全干燥后喷金#置于扫描电子显微镜下观测=SL第期徐亚慧#等$反应器形式及污泥形态对厌氧氨氧化菌群落结构的影响表DQ反应器的主要特征9&1,$DQK&-)A+&%&A*$%-(*-A(/-$%$)*%$&A*%(3($/-)*+$$Y0$%-#$)*)1+83’)7c5O34@13V’23+E1.7;c3V’23+E1.7;c2/*E,123+E1UB7;2/*E,123+E15;PR0’,(:1]:!$i$C$$i$#31:@]ƒ#C‚!$#K‚!###‚!$#J‚!$O\]!:E.^ZZZ$iK‚iKiK‚#i$@j0+,(1CiK‚CiSLiL‚Si%Si‚Si%CiL‚Si$’@1)+3/’*+,3/:1]+!#iK#$iK/*-,(1*3?jg%]!:E.^Z#$‚#KS$‚!$$S$$‚#$$#K$‚!$$/*-,(1*3?\Z#]!:E.^ZK‚#$L$‚#S$ZZ/*-,(1*35\O]!:E.^ZK$‚L$K$‚L$#$‚!$$K$‚L$?)1:’0+,)+31]!aE.:Z!.9Z#i$$iSi#$i!?)1:’0+,1--/8/1*84]€nJ$L$‚S$S$‚J$L$‚C$DVEQ试验分析方法DVEVDQ水质监测5\O采用重铬酸钾法%氨氮采用纳氏试剂分光光度法%亚硝酸盐采用?G!G萘基G乙二胺分光光度法%@j值及温度采用@j计探头!德国bPb%溶氧采用O\测定仪!德国bPb%T^;;采用重量法=DVEVBQ8^@提取G5?L扩增利用B+23O?7提取试剂盒提取污泥总O?7=7*+::’‘细菌的M5R特异性引物&KGL’见表#=M5R反应体系!K$’^为K’^M5R缓冲液%%’^$i#K::’,]^9?PM2%’^$’:’,]^正向引物%’^$’:’,]^反向引物%$i#K’^i#K.P+WO?7聚合酶%#’^O?7模板=反应器条件为JKƒ预变性K:/*#JKƒ变性:/*#在特定退火温度下退火:/*#C#ƒ延伸iK:/*#整个过程进行!K个循环#最后C#ƒ下延伸$:/*=通过€的琼脂糖凝胶电泳检测M5R产物=表BQ5?L扩增中采用的引物9&1,$BQ5%-#$%(&)/5?LA)/-*-)(%&)&##Y1&A*$%-&DU!%L^@2$)$(3+)E13E)’(@@)/:1)221W(1*81!KsG!s+**1+,/*E31:@]ƒ)1-1)1*81+*+::’‘A+831)/+7:‘!LSPP5Q577PQ555Q777QQKK&KGL’L;)R?7E1*17:‘S#$77775555P5P75PP7QPQ555&KGL’DVEVFQ克隆文库分析和DU!%8^@克隆文库的统计学分析克隆文库的建立及分析借鉴了王惠等的研究方法&C’=香农指数!;6+**’*!j#种群丰度!56+’以及稀疏曲线采用T\Pj.R软件!633@$VVV=:’36()=’)E]V/a/];6+**’*%633@$,VVV=:’36()=’)E]V/a/]86+’来计算=所取序列在Q1*A+*a中的编码为X5#$!%L!GX5#$!%SK=BQ结果与讨论从K个污泥样品的L;)R?7基因克隆文库中#随机选取#%#个阳性克隆子进行测序#构建K个+*+::