分子生物学技术在废水脱氮工艺微生物学研究中的应用

第6卷第5期2011年5月385分子生物学技术在废水脱氮工艺微生物学研究中的应用秦宇1,2，郭劲松2，方芳2（1.重庆交通大学河海学院，重庆400074；2.重庆大学城市建设与环境工程学院，重庆400045）摘要：分子生物学作为一门现代生物学技术，弥补了常规微生物学试验的不足，能对环境样品中的微生物进行原位观察，有效、快速、准确地反映环境样品中的微生物信息。为总结分子生物学在废水脱氮领域微生物学研究中的应用，介绍了最常用的几种相关技术，并以SHARON、ANAMMOX、CANON以及OLAND等新型生物脱氮工艺为例，回顾了分子生物学技术在该领域的研究进展，同时对其在该领域的发展进行了展望。关键词：分子生物学；微生物；新型脱氮工艺中图分类号：X703.1文献标志码：A文章编号：1673－7180(2011)05－0385－5ApplicationofmolecularbiologytechnologyonmicrobiologystudyofnitrogenremovalprocessesinwastewatertreatmentQinYu1,2，GuoJinsong2，FangFang2(1.SchoolofRiverandOceanEngineering,ChongqingJiaotongUniversity,Chongqing400074,China;2.FacultyofUrbanConstructionandEviromentalEngineering,ChongqingUniversity,Chongqing400045,China)Abstract:Asamoderntechnology,molecularbiologywouldcompensateforthedefaultsoftraditionalones.Withoutcultivation,someinformationaboutmicroorganismwouldbequicklyeffectivelyandaccuratelygained.Toretrospecttheapplicationanddevelopmentofmolecularbiologytechnologyonthemicrobiologystudyofsomenovelnitrogenremovalprocesses,sometypicaltechnologieswereanalyzed,andtheprocesssuchasSHARON,ANAMMOX,CANONandOLANDweretakenforexample.Meanwhile,theprospectofmolecularbiologytechnologieswasforecasted.Keywords:molecularbiology；microorganism；novelnitrogenremovalprocess水体氮污染威胁到我们赖以生存的生态环境，开发经济有效的生物脱氮技术已成为国内外的研究热点，其中新型脱氮工艺，如SHARON（singlereactorhighactivityammoniumremovalovernitrite，短程硝化反硝化），ANAMMOX（anaerobicammoniumoxidation，厌氧氨氧化），CANON（completelyautotrophicnitrogenremovalovernitrite，一体化自养脱氮），OLAND（oxygenlimitedautotrophicnitrificationanddenitrification，限氧硝化/反硝化）等，以其高效节能的特点近年来更是受到学者的广泛关注。由于这类工艺在反应原理上与传统脱氮工艺有本质上区别，其机理研究日益成为研究重点。新型脱氮工艺反应器内微生物学研究是其机理研收稿日期：2010-04-20基金项目：国家自然科学基金资助项目(50608071)；重庆大学研究生创新项目(200811A1A0120301)；重庆交通大学引进人才科研启动基金资助项目作者简介：秦宇(1981－)，女，讲师，主要研究方向：废水生物处理理论与技术，[e-mail]中国科技论文在线SCIENCEPAPERONLINE第6卷第5期2011年5月386中国科技论文在线SCIENCEPAPERONLINE究的一个重要组成部分。传统微生物学实验虽能在一定程度上检测出新型脱氮工艺中某类已知细菌的总数、通过功能判断以及外表观测确定功能菌种等，但对于微生物多样性及其在环境领域作用的了解仅靠传统的微生物学方法如显微镜、菌种培养等是不够的，这主要是由于微生物形态简单，缺乏明显的外部特征；而且由于难以模拟大多数自然环境中微生物生长繁殖的真实条件而不能获得微生物的纯培养[1]；此外，一些细菌的世代周期很长，比如ANAMMOX工艺中的厌氧氨氧化菌，其世代周期在11d以上，很难采用培养的方法进行分离[2]。再加上如选择性培养基计数等定量方法的不准确性，使得现今对于处理工艺中微生物与处理效果相关性的研究仍处于“黑箱”阶段。此外，由于新型脱氮工艺关于其机理研究尚处于初级阶段，到底有哪些微生物参与了反应尚不明确，这也使得采用常规微生物学手段有一定的困难。因此，为了更好地研究新型脱氮工艺的反应机理，为其控制反应条件提供理论依据，为实际应用奠定理论基础，迫切需要其他的生物学新技术。近年来，分子生物学技术因其能对环境样品中的微生物进行原位观察，且能快速、灵敏、有效得到遗传水平上环境微生物的多样性信息，在环境领域得到了重要进展，随着人们对新型脱氮工艺的关注，该技术在脱氮系统中微生物的多样性、系统发育地位、种群结构以及与功能的相关性等研究中的成为了该领域的应用热点。笔者回顾分子生物学技术在废水脱氮工艺中微生物学研究方面的应用，并对其在该领域的发展进行展望。1分子生物学技术概述分子生物学(molecularbiology)是一门现代生物学，是在生物化学与遗传学、微生物学、细胞学、生物物理学等学科相结合的基础上发展起来的崭新学科[3]。它将研究对象主要集中于生物大分子——核酸（DNA和RNA）。分子生物学正对生物科学各个领域进行广泛渗透和影响，而成为带动整个生命科学的前沿学科，并已成为现代生命科学的“共同语言”[3]。目前，已开发并应用于环境领域。研究微生物群落的分子生物学技术主要有以下几种。1.1荧光原位杂交荧光原位杂交技术(fluorescentinsituhybridazation，FISH)问世于20世纪70年代后期，是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。该方法的特点是可以进行样品的原位杂交，避免细菌的纯培养过程。此外，该技术可以有效反应环境样品中细菌数量及空间位置，并具有定性、定量分析和空间位置识别特点，因此，FISH技术成为了微生物学的一个突破，近年来应用于环境中特定微生物种群的鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测。采用该技术已发现了许多新的微生物物种。1.2多聚酶链式反应多聚酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是由美国Cetus公司Mullis等在1985年建立起来的一套大量快速扩增特异DNA片段的系统，属DNA体外合成技术，类似于生物体内DNA的复制过程，重复经过若干个变性、退火、延伸这3步循环，就可以使目的DNA扩增放大，解决了环境样品中由于提取DNA含量过低而不能很好分析的难题。目前，PCR已成为分子生物学家手中不可或缺的工具，通过PCR，可以在几小时内将一个分子的遗传物质成百乃至上亿倍的复制。该技术具有特异性强、灵敏度高、快速、简便以及重复性好等特点和优点，短短几十年得到了迅速发展和应用。从PCR技术发明至今，该技术已不断得到改进，除经典PCR以外，还开发出了荧光定量PCR(Real-timePCR)等。1.3变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)由Myers等首先创建，属于DNA指纹图谱技术。PCR扩增产物在具有变性浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中具有不同的迁移位点，不同的G＋C含量在胶中产生不同分离的条带，每一条条带代表一个不同的微生物种群，通常用条带数目的多少来反映微生物种群的多样性，用条带的染色强度反映不同细菌种群的丰度。这样仅仅分析条带就能得到很有用的信息。DGGE在微生物分子生态学方面的应用，不仅使得人们对复杂微生态系统的解析成为可能，也使得对微生物群落动态变化的研究成为可能，近年来，该技术用于环境微生物种群研究的文章越来越多，涉及的领域也越来越广泛。1.4DNA克隆环境样品微生物分析的一个较突出的问题是得不到足够的目标物质进行分析。譬如10L生长到最大浓度的E.Coli培养菌只包含7mgDNA多聚酶I，许多其他蛋白质的量则更少。此外，微生物体内的蛋白质，能被纯化的部分几乎不到一半，真核细菌的蛋白质则更难得到，分子克隆技术的发展和应用克服了这一不足。分子克隆的主要技术要点是：将目标DNA片断插入一段自复制的DNA分子（克隆载体）中，而后目标DNA第6卷第5期2011年5月387片断就和载体复制在一起，将这个携带着目标DNA片断的载体在宿主细胞（如E.Coli或酵母菌）中克隆后就可产生大量的被插入的目标DNA片断。1.5DNA测序及序列分析与PCR类似，DNA测序采用高温使DNA双链变性，引物被退火后得到延伸。TaqDNA多聚酶也是DNA测序反应中常用的酶，它能使染料标记的DNA终端分布更加均匀，具有较高的测序准确度。此外，DNA序列分析是测序后一个重要步骤，不同微生物有不同DNA序列，因此经过准确和合理的序列分析即能鉴定目标微生物。目前，可以通过网络数据资源得到有关的序列信息，也可以应用软件在数据库中查询，还可以通过系统发育分析确定微生物在发育过程中种属关系。2分子生物学技术在新型脱氮工艺中的应用新型生物脱氮工艺按其脱氮反应及反应器类型的不同，主要可以分为SHARON、ANAMMOX、CANON以及OLAND等几种。这几种工艺的发展，为水处理工作者在生物脱氮设计方面提供了新的理论和思路，它们逐渐成为各国学者研究的焦点。2.1SHARON工艺SHARON(singlereactorhighactivityammoniumremovalovernitrite)工艺由荷兰Delft技术大学Hellinga等于1997年开发成功。该工艺的核心是利用硝化菌与亚硝化菌在较高温度(30~40℃)下不同生长速率，硝化菌的生长速率明显低于亚硝化菌的生长速率。通过控制温度和污泥龄将硝化菌自然淘汰，使反应器中的亚硝化菌占绝对优势，从而在同一个反应器内，先在有氧的条件下，利用亚硝化菌将氨氮氧化生成NO2－，然后在缺氧的条件下，以有机物为电子供体，将NO2－反硝化生成N2。该工艺的关键在于将NH4＋氧化控制在NO2－，阻止NO2－进一步氧化，然后直接反硝化。由于该工艺需对硝化菌进行有效淘汰而使亚硝化菌富集，所以之前很多研究者针对系统内如何培养、分离功能菌上进行了大量研究，如找到了适合亚硝化菌分离、生长的培养基，并得到其纯培养后进行了亚硝化菌的生理特性研究等[4]。但是由于亚硝化菌的富集时间需要60d[5]，且由于肉眼在辨别筛选菌落的过程中无法精确判断，这使得有些功能菌很可能被人为忽略掉。而分子生物学无需对工艺中微生物进行纯培养，可以在一次实验中发现可能存在的所有菌种并且得到精确判断，避免了常规培养中的人为误差，节省人力物力。Susanne等[6]首次应用现代分子生物学技术对SHARON工艺中的微生物组成情况进行了研究。他们采用PCR-DGGE-16SrRNA序列分析技术，对SHARON工艺中微生物样品进行分子生物学技术检测，研究结果显示，系统内至少存在4种不同微生物，并且其中有1种占主导地位(69%)的细菌与Ni