分子生物学在废水系统硝化细菌群落特征分析中的应用进展1

第24卷第6期水资源保护Vol.24No.62008年11月WATERRESOURCESPROTECTIONNov.2008分子生物学在废水系统硝化细菌群落特征分析中的应用进展黄燕,黄民生,戴兴春,朱勇,高尚,高岩(华东师范大学资源与环境科学学院,上海200062)摘要:较系统地介绍了与环境微生物相关的分子生物学研究方法,如克隆文库分析法、分子杂交技术、遗传指纹技术等,及其这些相关技术在硝化细菌群落结构与分布、多样性、动态性分析中的应用进展。结果表明,分子生物学技术在研究硝化细菌群落特征中发挥了重要的作用。关键词:硝化细菌;群落特征;分子生物学;综述中图分类号:Q71文献标识码:A文章编号:1004O6933(2008)06O0012O05ProgressintheapplicationofmolecularbiologytoanalysisofcommunitycharacteristicsofnitrifyingbacteriainwastewaterHUANGYan,HUANGMin2sheng,DAIXing2chun,ZHUYong,GAOShang,GAOYan(SchoolofResourcesandEnvironmentSciences,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200062,China)Abstract:Asystematicreviewofmolecularbiologyresearchmethodsappliedinenvironmentalmicrobiologyisgiven,includingclonelibraryprofiling,molecularhybridizationandgeneticfingerprinting.Progressintheapplicationofthesemethodstotheanalysisofcommunitycompositionanddistribution,diversityanddynamicanalysisofnitrifyingbacteriaisalsopresented.Theresultsshowthatmolecularbiologytechniquesplayanimportantroleinthestudyofthecommunitycharacteristicsofnitrifyingbacteria.Keywords:nitrifyingbacteria;communitycharacteristics;molecularbiology;applicationprogress近年来,随着城市人口的急剧增长,工农业生产菌(AmmoniaOxidizingBacteria,AOB),将亚硝氮氧化的快速发展,造成污染源和外排污染物数量剧增,因为硝酸盐的称之为硝酸菌(NitriteOxidizingBacteria,此不少污染物受纳水体的生态环境严重失衡。氮和NOB)。这两大菌群协同作用将氨氮转化为硝态氮,磷是引起水体富营养化的重要元素,因此氮和磷的其生长缓慢,对冲击负荷敏感,因此成为研究脱氮过去除一直是环境学科研究的重点。目前污水中氮、程的主要菌群。磷去除所采用的方法主要为生物去除法,即利用微硝化细菌群落组成的特征,在很大程度上决定生物氨化、硝化以及反硝化作用去除污水中的氮,利着废水脱氮处理的效果。因此,全面了解硝化细菌用聚磷菌过量吸收磷而减少排放。种类、数量及时空分布变化等生态特性、种群结构及硝化细菌是生物硝化脱氮中起主要作用的微生生态功能关系并对系统进行优化调控,是确保脱氮物,会直接影响硝化效果和生物脱氮的效率。传统处理系统稳定、高效运行的关键,近年来已成为国内的硝化菌群是典型的好氧自养型细菌,呈革兰氏阴外的研究热点。性,能够氧化氨氮或亚硝氮为硝酸盐[1]。硝化细菌硝化细菌的生长速度极其缓慢,现常用的分离分为两类:将氨氮氧化为亚硝酸盐的称之为亚硝酸纯化方法,如最大可能数、极限稀释、选择性平板等基金项目:上海市建设与交通“十一五”重点科研项目(2006)作者简介:黄燕(1982—),女,浙江宁波人,硕士研究生,研究方向为水处理技术。E2mail:[e-mail]通讯作者:黄民生,教授,E2mail:[e-mail]·12·也不能有效地获得硝化细菌,这些传统方法不但费时费力且细菌计数困难、不准确,这些都明显限制了人们对硝化细菌的研究与应用。近年来,分子生物学方法已经成为现代环境微生物学研究的重要手段,人们对硝化细菌分子水平上的研究越来越多,对其群落结构的分析也越趋深入。1与微生物群落结构分析相关的分子生物学研究方法对环境中微生物种群的类型和数量进行及时和准确的分析测定在微生物生态研究中十分重要,传统的微生物分析测定方法,包括显微镜微生物形态观察、选择性培养基计数、纯种分离和生理生化鉴定等,在环境样品研究中都存在一定的缺陷。随着近代分子生物学技术的发展,不依靠纯培养的微生物群落结构的分析方法已得到广泛发展和应用。近年来,针对目前传统微生物分析方法存在的问题,在环境微生物领域,国际上诸多国家先后展开了分子生物学研究方法的建立和生物学评价工作,更精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性,基于DNA/RNA的现代分子生物技术在废水处理、生物修复等环境污染治理领域已有广泛的研究应用。迄今,国内外就目前所开展的研究来看,用于微生物群落结构的分析技术主要有以下几种。1.1克隆文库分析法(clonelibraryprofiling)在分析环境样品中核酸分子的种类和数量时,由于直接提取的核酸分子的量很少,不能用于直接分析,一般都是通过PCR扩增和构建克隆文库的方法。通过对文库中各转化子序列的测定,分析文库中标记序列的类型和出现频率,就可以知道该环境样品种的这些基因的种类和相对数量,从而获得物种组成的信息,得到微生物群落种群组成的分析数据。其中,以16SrRNA/DNA为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法。该技术主要利用不同微生物在16S核糖体及其基因序列上的差异来进行微生物种类的鉴定和定量分析。虽然该方法比较耗时,且需要大量财力支持,但是由于该方法对微生物细胞中16SrRNA基因进行特异扩增后对核苷酸序列进行测定,并与已知菌种16SrRNA进行比较,以此进行微生物鉴定和微生物系统学研究,因此该方法是目前比较准确的方法之一,在微生物生态学研[2]究中占有重要的地位。1.2分子杂交技术(molecularhybridization)两条序列一样或相近的核酸片段在一定条件下能退火结合在一起,形成稳定的双链结构。根据这个原理,以一条特异标记(荧光、同位素或DIG等)的核酸片段为探针,就可以检测出另一条靶核酸序列的存在。用已知的标记序列作为探针,可以检测微生物群落样品中特定的微生物种类存在状况及其种群水平的高低。可以直接对样品进行分析的荧光原位杂交(FISH)、原位PCR(IS-PCR)、基因芯片(Microarrays)等受到研究者的青睐。其中,荧光原位杂交(FISH)是一项利用标记的DNA或RNA探针直接在染色体、细胞或组织水平定[3-4]位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术。FISH利用高度特异的寡聚核苷酸探针杂交可以得到特定微生物在环境中的存在、分布、丰度以及整个微生物群落的组成、结构及其多样性等全面信息。1.3基于PCR扩增的遗传指纹技术(geneticfingerprinting)该方法是指将代表微生物群落结构的核酸分子进行各种形式的凝胶电泳,从而将代表微生物群落种各种不同种群的核酸分子区分开。凝胶电泳中各微生物群落核酸分子的迁移行为就构成了该群落特异的遗传指纹图谱。该方法的一大优点就是可以同时对比大量的微生物群落样品。DNA指纹技术的潜在问题则是总DNA的提取和PCR扩增过程存在的影响因素。没有任何一种DNA提取方法是绝对可靠的[5],而且PCR过程中,如通用引物并非完全通用、GC含量影响、Taq酶活性等等,都会导致误差产生。无论选择杂交技术还是DNA指纹技术,它们总是描述群落中占主要部分的种类。用于群落结构分析的指纹图技术中,最常用的是用16S/18SrRNA基因序列可变区的扩增以及DGGE/TGGE电泳分析技术,目前已经被广泛用于分析微生物的区系结构组成与动态变化。此外,随机扩增技术(RAPD)、扩增rDNA限制性分析(ARDRA)、限值性片段长度多态性分析(RFLP/T-RFLP)等也被用于监测微生物群落结构的动态变化或者比较不同微生物群落样品的结构差异。1.4实时定量PCR技术(real2timePCR)所谓real2timePCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前根据荧光定量途径的不同,real2timePCR测定主要包括3种方法:SYBRGreen荧光定量法和Taqman探针法及MolecularBeacon。实时荧光定量PCR具有特异性强,能有效解决PCR污染问题,自动化程度更高等优点,与其他的分子生物学技术的联合应用,使人们不仅可以定性,也可以定量研究微生物群落结构组成及数量变化,深入探索微生物群落与环境因子之间的相互作用及其·13·动态变化过程。实时定量PCR技术已广泛应用于研究自然环境的微生物生态系统中,如土壤、水体、沉积物、活性污泥、肠道等复杂微生物生态系统中重要功能种群的定量研究中。2分子生物学技术在硝化细菌群落结构分析中的应用通过分子生物学方法可以方便、快速、准确地获得处理设施中的微生物情况,为设施运行提供参考资料;通过分析微生物的多样性,还可以为构建人工生态系统提供依据;也可以为进一步开发利用不可培养的微生物的特殊功能基因提供初步资料。硝化细菌在不同的环境中往往形成不同的优势菌群,在污水处理过程中,硝化细菌的优势菌群随着反应系统和运行特征的不同而具有各自的特征,目前较多的研究者对于污水处理系统中硝化优势菌株的组成进行了大量研究。2.1硝化细菌群落的多样性研究DGGE和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析,是目前可以探知最为完整的环境微生物菌群结构的分子生物学技术,已被广泛引用到分子微生物生态学研究领域,尤其是在微生物多样性的研究上。许玫英等[6]采用PCR2DGGE技术,研究了含高浓度氨氮的废水处理系统不同驯化时期活性污泥样品中总的细菌类群的差异性。结果表明所检测到的氨氧化细菌优势菌群均属于变形细菌的β亚类,与Nitrosomonassp.相比具有较高的相似性。活性污泥驯化成熟后,废水处理系统中AOB的活性有明显提高,活性污泥中的细菌类群更加集中,优势菌群相对稳定,系统对废水的处理效率也相应提高。Pynaert等[7]报道了生物转盘反应器(RBC)高效自养生物脱氮系统的微生物多样性,与接种污泥相比,生物膜中好氧氨氧化菌(AOB)种群组成发生了明显的变化,并发现优势种为Nitrosomonassp.。[8]Tsuneda等采用DGGE技术分析硝化颗粒污泥中硝化菌群组成,发现Nitrosococcusmobilis是主要的硝化细菌之一,当氨负荷从01125kg·m-3·d-1上升到0182kg·m-3·d-1,出现了3种新的硝化细菌,与Nitrosomonasmarina相似性最高,而样品中没有检测到Nitrosospira的相关菌种,说明高浓度氨环境有利于Nitrosomonas的生长。嵌套式PCR(NestedPCR)的联合应用拓宽了DGGE的应用范围,能对活性污泥中特定微生物菌群作分析,使研究结果更有实际意义。该技术能检[9]测出样品中丰度低的微生物,Philips等报道采用嵌套式PCR能检测到质量分数低于0101%的氨氧·14·[10]化菌。Boon等采用嵌套式PCR和DGGE对取自比利时15家废水处理厂活性污泥中微生物种群结构作了较详尽的比较分析。实验分别对活性污泥中常见的Bacteria、α2Proteobacte