高温短程反硝化菌BrevibacillusspXF03特性及其降解动力学

·研究报告·生物技术通报BIOTECHNOLOGYBULLETIN2014年第1期随着工业化的发展，水体富营养化现象日趋严重，去除水中氮素污染已成为当今水污染防治领域的一个热点问题［1，2］。目前普遍认为生物脱氮是从污水中去除氮素污染的经济有效的方法之一［3，4］。在诸多污水脱氮新技术中，应用广泛、发展较快及最经济高效的有短程硝化反硝化、同步硝化反硝化及厌氧氨氧化等，它们因具有节省曝气量、提高反应速率、节约碳源、缩短反应时间等优点［5］，越来收稿日期：2013-07-29作者简介：郝敏娜，女，硕士研究生，研究方向：水污染控制；E-mail：[e-mail]高温短程反硝化菌Brevibacillussp.XF-03特性及其降解动力学郝敏娜 杨云龙 葛启隆（太原理工大学环境科学与工程学院，太原030024）摘要：采用梯度驯化方法，使得菌株Brevibacillussp.XF-03在高温（50℃）条件下，能够降解1000mg/L亚硝态氮，并通过单因素试验对其生长碳源和C/N进行优化，结果显示，菌株Brevibacillussp.XF-03短程反硝化最适碳源为琥珀酸钠，C/N为12∶1。在此最佳条件下，42h对初始浓度为100mg/L亚硝态氮去除率为95.1%。对该菌株亚硝态氮降解动力学过程进行模拟，符合基质抑制型的Haldane模型，各参数分别为：最大比降解速率（μmax）=1.28h-1，半饱和常数（KS）=451.42mg/L，底物抑制常数（Ki）=176.77mg/L。初步探讨了亚硝酸盐还原酶（NIR）活性，在该菌株生长指数期的后期，亚硝酸盐还原酶比活力达0.279（U/mgprotein）。关键词：Brevibacillussp.XF-03高温短程反硝化亚硝态氮降解动力学酶活性CharacteristicsandDegradationKineticsofThermophilicShotcutDenitrifierBrevibacillussp.XF-03HaoMinnaYangYunlongGeQilong（CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering，TaiyuanUniversityofTechnology，Taiyuan030024）Abstract: ThedenitrifierBrevibacillussp.XF-03couldreducehighnitriteconcentration（1000mg/L）undertheconditionofhightemperature（50℃）bythemethodofgradientdomestication.TheeffectsofcarbonsourceandC/Nongrowthanddenitrificationofthedenitrifierwereoptimizedbysinglefactorexperiments.TheresultsshowedthattheoptimumshortcutdenitrificationcarbonsourceofBrevibacillussp.XF-03wassodiumsuccinate,optimumC/Nratio12∶1.Undertheoptimalcondition,thenitriteremovalefficiencyreached95.1%within42hourswhentheoriginalconcentrationofNO-2-Nwas100mg/L.NitritedegradationkineticstudiesindicatedthatthestrainfollowedHaldane’smodel,andtheparameterswere：μmax（maximumspecificrate）=1.28h-1,Ks（half-satrurationconstant）=451.42mg/L,Ki（inhibitionconstant）=176.77mg/L.Nitritereductase（NIR）activitywaspreliminarydiscussed.TheNIRspecificactivityreached0.279（U/mgprotein）atthelagphaseofexponentialgrowth.Key words: Brevibacillussp.XF-03HightemperatureShortcutdenitrificationNitritedegradationkineticsEnzymeactivity越受到人们的重视［6，7］，实现这些新技术的关键是获得具有较高脱氮能力的微生物。此外，以上新技术多适用处理中低温环境的污水［8，9］，若处理高温污水则需对污水进行降温，这给生物法处理高温污水带来较大困难。本文研究菌株Brevibacillussp.XF-03的高温短程反硝化特性及其亚硝态氮降解动力学，以期为短程硝化反硝化工艺的应用以及传统反硝化过程中亚硝生物技术通报BiotechnologyBulletin2014年第1期178态氮积累问题的解决提供技术参数与新的菌源。1材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株供试菌株：Brevibacillussp.XF-03，来源于太原理工大学环境科学与工程实验室，经鉴定为短芽孢杆菌属（Brevibacillussp.），GenBank登录号为KF052620。试验初步证明在高温条件（50℃）下，该菌具有较好的短程反硝化能力。1.1.2培养基LB富集培养基（g/L）：胰蛋白胨10；酵母浸出粉5；NaCl10；pH7.0-7.5。短程反硝化培养基（g/L）：NaNO2适量；KH2PO41.5；Na2PO4·7H2O7.9；MgSO4·7H2O0.1；琥珀酸钠适量；微量元素溶液2mL；pH7.0-7.5。微量元素溶液成分（g/L）：EDTA50.0；ZnSO42.2；CaCl25.5；MnCl2·4H2O5.06；FeSO4·7H2O5.0；（NH4）6Mo7O2·4H2O1.1；CuSO4·5H2O1.57；CoCl2·6H2O1.61；pH7.0-7.5。以上培养基121℃高压灭菌20min，固体平板和斜面培养基均在上述培养基中加入1.8%的琼脂粉。1.2方法1.2.1菌株Brevibacillussp.XF-03的短程反硝化驯化将本实验室保藏的菌株Brevibacillussp.XF-03接种至装有LB培养液的三角瓶中，30℃，160r/min摇床振荡活化2代，并将次级培养物活化至细菌对数生长期，作为接种体使用。取活化后的菌液10mL，接入装有100mL培养液的三角瓶中，摇床恒温振荡。以琥珀酸钠作为唯一碳源和能源，利用NO2--N作为唯一氮源，采用梯度驯化的方法首先对细菌进行升温培养。驯化培养过程按10%梯度接种的方法，温度梯为：30℃→35℃→40℃→43℃→46℃→48℃→50℃。菌株在50℃下生长稳定后，再对其进行亚硝态氮浓度梯度驯化。亚硝态氮浓度梯度增加依次为：50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、1000mg/L。同时，在驯化的过程中定期监测水质并观察微生物的生长情况。1.2.2菌株Brevibacillussp.XF-03短程反硝化条件优化将处于对数生长期的菌液接入100mL短程反硝化培养基中，通过调节碳源（葡萄糖、苯酚、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、乙醇、琥珀酸钠）和C/N（3∶1，6∶1，9∶1，12∶1，15∶1，20∶1），50℃、160r/min摇床振荡培养，定期测定培养液中菌体生长量与NO2--N含量。考察碳源与碳氧化（C/N）对菌株Brevibacillussp.XF-03生长及短程反硝化能力的影响，每组试验设3个重复。1.2.3短程反硝化动力学研究在最佳试验条件下，应用Haldane方程对菌株生长和亚硝态氮降解特性进行动力学研究［10］。为用回归曲线求出准确的动力学方程，动力学试验在较宽的NO2--N含量范围内进行，即0-1000mg/L。NO2--N浓度选择如下：0-200mg/L之间，每40mg/L一个浓度梯度；200-600mg/L之间，每100mg/L一个浓度梯度；600-1000mg/L之间，每200mg/L一个浓度梯度。将菌悬液分别接种到装有上述不同初始NO2--N浓度的短程反硝化培养基中，摇瓶振荡培养，每隔适宜时间取样检测培养液中的菌体含量和残余NO2--N含量。1.2.4粗酶液的提取将处于不同生理时期的菌液离心（8000r/min，10min），弃去上清液，收集菌体，用0.01Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH7.2）清洗后重悬细胞，再次离心，重复3次，留取菌体沉淀。按原菌液体体积的1/5-1/10加入裂解液，制成悬浮菌液，裂解液的成分为：pH8.0的50mmol/LTris-HCI缓冲液、2mmol/LEDTA、100mmol/LNaCl，置于冰水浴中超声破碎。破碎液于12000r/min，4℃离心20min，收集上清液即为粗酶［11］，低温保存待用。1.2.5菌体OD600测定可见分光光度法，细胞干重采用干燥恒重法测量，根据细胞干重标准曲线将吸光度转换为细胞干重［12］；亚硝态氮测定：N-（1-萘基）-乙二胺光度法［13］；亚硝酸盐还原酶（NIR）活力测定：测定系统总体系3mL，内含1.0mLNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH7.2），1mL粗酶液以及1mL0.01mol/L的亚硝酸钠溶液，试剂全部加入后立即取适量上述混合液，测340nm处的吸光度，剩余待测液在常温静置20min后测其340nm处的吸光度［14］。定义亚硝酸盐还原酶（NIR）活力单位（U）为每分钟转化1μmol亚硝酸盐氮所需酶量。总蛋白含量用Bradford法测定［15］，酶的比活力以每毫克蛋白质中所含酶的活力单位数计算。试验数据分析借助Matlab软件。2014年第1期179郝敏娜等：高温短程反硝化菌Brevibacillussp.XF-03特性及其降解动力学2结果2.1碳源对菌株Brevibacillussp.XF-03短程反硝化影响图1为不同碳源情况下，42h后菌株各自生长及NO-2-N降解情况。由图1可以看出菌株Brevibacillussp.XF-03短程反硝化的顺利进行对碳源有一定的选择性。该菌几乎不能以乙醇、苯酚、酒石酸钾钠作为唯一碳源生长；而对葡萄糖而言，菌体在其中所需的适应阶段较长，亚硝态氮降解也不充分，可能是由糖类物质降解过程的复杂性引起的。分别以柠檬酸钠和琥珀酸钠为碳源时，菌株Brevibacillussp.XF-03均能较好地生长，与以柠檬酸钠为碳源相比，当以琥珀酸钠为碳源时，亚硝态氮降解率较高42h亚硝态氮由100mg/L降解到5.9mg/L，降解率达94.1%，说明琥珀酸钠为该菌株的最适碳源。菌株Brevibacillussp.XF-03进入对数生长期，在该时期内，短程反硝化作用明显加强，因为这个时期（18-36h）是细菌生长和繁殖最旺盛的时期，细胞合成所需要的能量和还原力主要在这一阶段被消耗，因此反硝化作用主要在这一时段内完成。培养42h，NO-2-N从100mg/L降至4.90mg/L，去除率为95.1%。在对数期后期，有效细菌的数目虽逐渐减少，而亚硝酸盐仍有少量降低，此时很可能是细菌的同化起主要作用。OD600OD600ӊ⺍ᘱ≞⎃ᓖӊ⺍ᘱ≞⎃ᓖmg/L1.41.21.00.80.60.40.20.0㪑㨴㌆Ḑ⃜䞨䫐҉䞷⩕⧰㤟䞊䞂⸣䞨䫮䫐020406080100䞨䫐碳源图1碳源对菌体生长及NO-2-N降解的影响2.2碳氮化对菌株Brevibacillussp.XF-03短程反硝化影响以琥珀酸钠为唯一碳源，亚硝酸钠为唯一氮源，固定碳源含量，通过调节亚硝酸钠含量控制碳氮比。由图2可知，当碳氮化（C/N）小于12时，亚硝态氮去除率及菌株生长情况随着C/N增加而提高，C/