高效反硝化菌强化固相碳源生物脱氮特性研究芦婷

957国家自然科学基金(51378021)和国家水体污染控制与治理科技重大专项(2012ZX07102-002)资助收稿日期:20160513;修回日期:20170505;网络出版日期:20170909北京大学学报(自然科学版)第53卷第5期2017年9月ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisPekinensis,Vol.53,No.5(Sept.2017)doi:10.13209/j.0479-8023.2017.114高效反硝化菌强化固相碳源生物脱氮特性研究芦婷杨璐华杨飞飞吴为中†北京大学环境科学与工程学院,北京100871;†通信作者,E-mail:[e-mail]摘要以聚丁二酸丁二醇酯(PBS)作为固相可生物降解模式碳源的生物填充床,针对分离获得的高效反硝化菌开展强化生物脱氮的特性研究,并利用荧光定量PCR解析反应器的微生物群落结构。结果表明,投加反硝化菌(W14)可以明显地提高反硝化脱氮效率,当水力停留时间(HRT)为0.5h时,反硝化菌强化脱氮生物反应器的脱氮效率达到90%以上,且能有效地降低出水残余的DOC浓度。荧光定量PCR结果表明,高效反硝化菌投加强化能够增加nirS基因丰度和比例,较好地解释了不同接种生物反应器的脱氮效果差异,即反硝化菌的强化作用能有效增加反硝化菌数量并强化脱氮效果。关键词反硝化菌;生物强化;脱氮;固相碳源;生物填充床;荧光定量PCR中图分类号X172DenitrificationPerformanceofaDenitrifier-AugmentedPacked-BedBioreactorwithSolidCarbonSourceLUTing,YANGLuhua,YANGFeifei,WUWeizhong†CollegeofEnvironmentalSciencesandEngineering,PekingUniversity,Beijing100871;†Correspondingauthor,E-mail:[e-mail]stigatedthebioaugmentationperformancesofaselectedbacterialstrainfordenitrificationinapackedbedbioreactorusingPBSassolidcarbonsource.FluorescencequantitativePCRwasemployedtoanalyzethemicrobialcommunitycompositioninthebioreactor.ResultsindicatedthatthedenitrifiernamedW14couldremarkablyimprovedenitrificationefficiency.AtHRTof0.5h,nitrogenremovalwasfoundtobehigherthan90%andtheresidualDOCofeffluentwasgreatlyreduced.AdditionofselecteddenitrifiersledtoanincreaseofnirSgeneabundanceandproportion,indicatingthatinoculationofselectedbacterialstraincouldboostdenitrifiers’proliferationandenhancenitrogenremovaleventually.Keywordsdenitrifier;bioaugmentation;nitrogenremoval;solidcarbonsource;packedbedbioreactor;fluore-scencequantitativePCR废水的生物强化处理技术指通过添加一种或多种高效的特定功能微生物来优化污水原有微生物群落结构,提高降解菌群活性,增加降解菌群数量,以期实现强化微生物群落降解目标污染物能力的目的[1]。通过向污水脱氮系统中投加高效硝化或反硝化菌,能够有效地提高微生物菌群的硝化或反硝化性能,进而提高脱氮效率[2–4]。分段式硝化–反硝化工艺是污水处理厂应用较为广泛的传统深度脱氮处理工艺,如A/O和A2/O等[5–8],但这些工艺的脱氮效率较低,碳源不足是制约其反硝化处理效果的主要原因[9]。对于多数的污水,碳源不足往往是由于在一级生化反应中消耗了过量的碳源造成的。此外,在反硝化单元中也可能有大量非反硝化异养菌存在,与反硝化菌产生碳源竞争,进一步限制脱氮效率的提高。针对内碳源不足的问题,现有工艺多采用投加液体碳源的方式来补充碳源,如甲醇、乙醇、乙酸等[10–12],但这类工艺往往由于投加量控制困难而发北京大学学报(自然科学版)第53卷第5期2017年9月958图1摇床序批实验装置示意图Fig.1Experimentalsetupsofshakingincubator表1序批实验反应体系接种来源Table1Inoculationsourcesofbatchtestsreactionsystems反应体系编号接种来源1100mL活性污泥(肖家河污水处理厂二沉池)2100mL菌液(W14)说明:菌液浓度OD600≈0.8。生出水水质波动及出水二次污染。为此,有学者提出应用水不溶性可生物降解物质作为反硝化碳源的设想,利用其仅能在微生物酶作用下得以分解利用的特点来避免外部碳源添加的缺陷,这一工艺称为“固相反硝化”(solidphasedenitrificaiton)[13]。近年来,多种可生物降解聚合物(biodegradablepolymers,BDPs)用于固相反硝化研究,如PCL,PBS,PLA,PHBV和混合碳源等[14–18]。但是,有研究表明,使用BDPs作为固相碳源进行反硝化,有可能发生出水有机物浓度过高的二次污染[19]。推测其主要原因是在反硝化系统中除反硝化菌外,还存在大量消耗固相碳源的非反硝化异养菌,使得碳源被过量分解,从而导致残余有机物随出水流出。使用高效反硝化菌强化的固相反硝化系统,有望提高反硝化菌数量和活性,提高对有机碳源的有效利用并抑制非反硝化异养菌的生长,从而避免以上问题的发生。本研究从实验室运行效果良好的反硝化生物滤池中分离出一株高效反硝化细菌,富集培养后,投入固相反硝化反应器系统,探讨其生物强化脱氮效果及出水残余有机物水平,并利用荧光定量PCR技术,对反应器内部微生物丰度变化进行研究,揭示菌群结构与反应器处理效率之间的关系,以期为深度脱氮工艺技术提供理论依据和技术支撑。1材料与方法1.1高效菌种来源从实验室已有的长效稳定运行的多个固相碳源反硝化生物反应器中,取固相碳源填料上的生物膜,分离、纯化、筛选出相对高效的反硝化菌株菌(W14),经初步鉴定为Diaphorobacter属,其菌落形态为圆形,表面光滑有光泽,边缘整齐,呈橘红色。1.2试验材料模式碳源:选择聚丁二酸丁二醇酯(PBS)作为模式固相碳源,即反硝化固相碳源和生物膜载体。采购自安徽省安庆市和兴化工有限责任公司,为直径3mm左右的椭圆球状体。高效菌剂是本研究实验室分离的反硝化菌种经富集培养后形成菌液,与活性污泥按照不同体积比组合形式对固相碳源反硝化生物填充床进行投加强化。活性污泥取自北京市海淀区肖家河污水处理厂的二沉池。模拟配水:采用NaNO3和KH2PO4配制而成,其中NO3-N浓度约为15mg/L,PO4-P浓度约为3mg/L。1.3反硝化菌强化脱氮的摇床序批实验在摇床序批实验中,以500mL锥形瓶为反应体系。在500mL锥形瓶中加入300mL人工配水溶液(最终浓度:NO3-N为50mg/L,PO4-P为5mg/L),固体碳源PBS80g。装置如图1所示。锥形瓶置于恒温振荡器反应器中,在25ºC,100rpm条件下反应,每24小时换一次配水(配水浓度:NO3−-N为50mg/L,PO4-P为5mg/L)。设置两组上述的反应体系,接种来源如表1所示,分别进行挂膜驯化,每24小时测定一次溶液中NO3−-N浓度,当溶液中NO3−-N去除率在90%以上,并连续一周效果保持稳定时,即认为挂膜成功。待反硝化效果稳定后,进行动力学实验,每两小时取一次样,监测不同体系中硝酸盐氮浓度和DOC随时间的变化。1.4反硝化菌强化固相碳源的生物填充床试验固相反硝化填充床试验装置如图2所示。填充床反应器由有机玻璃制成,反应器主体为圆柱形,内径50mm,高500mm。反应器中填充有固体碳源PBS,填充高度为250mm,质量约340g。模拟的人工配水从配水箱经过蠕动泵泵入填充床底部,经过反应器处理的出水从填充床顶部流出。反应器置于水槽中,恒温水浴控制温度为25°C。芦婷等高效反硝化菌强化固相碳源生物脱氮特性研究959图2填充床试验装置示意图Fig.2Experimentalsetupsofpackedbedbioreactor固相反硝化填充床设置3组平行试验,生物强化方式分别为:100mL活性污泥接种(1号)、活性污泥(50mL)与W14反硝化菌液(50mL)按1:1接种(2号)、W14反硝化菌液(100mL)接种(3号),比较高效反硝化菌强化对脱氮效果和出水水质的改善。采用静态方式进行接种和挂膜驯化,每隔5小时换水,反复换水驯化3天后开始连续进水试验。以空床水力停留时间(HRT)为2h,启动连续运行(0~31天),待效果稳定后,依次缩短至1h(32~62天)和0.5h(62~140天),考察反应系统的抗冲击负荷能力。对反应器进水NO3-N及出水NO3−-N,NO2−-N,NH4+-N,DOC这5个水质指标进行监测。反应器运行过程中,根据需要定期投菌,进行强化。1.5荧光定量PCR试验在反应器运行的第20,59,106和140天(分别记为第1,2,3和4次取样),分别从3组反应器中随机取出1g填料,经超声波(36kHz)振荡30分钟后,使生物膜完全脱落下来。将全部菌液抽滤通过0.22μm滤膜,将微生物转移至滤膜上;把滤膜剪碎在2mL离心管中,采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(上海博彩)进行DNA提取。由上海美吉生物医药科技有限公司协助测定,对细菌16SrRNA和亚硝酸盐还原酶基因nirS进行定量。采用引物序列分别为16SrRNA(Eub338:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’;Eub518:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和nirS(cd3AF:5’-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3’;R3cd:5’-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3’)。1.6水质分析方法水样经0.45μm滤膜过滤后测定各项指标。NO3−-N采用紫外分光光度法进行测定,NO2−-N和NH4+-N分别采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和水杨酸次氯酸钠分光光度法进行测定,水样DOC浓度使用TOC分析仪(HACH,IL530TOC-TN)进行分析。2结果与分析2.1反硝化菌强化脱氮的摇床序批实验脱氮特性分析在序批实验的两个反应体系均达到稳定运行状态后,共进行3次动力学实验,结果如图3所示。从图3(a)可以看出,污泥接种的摇床1号反应体系在前5个小时内,NO3−-N浓度和降解时间近似呈线性关系,降解过程符合零级动力学,在7h时下降到1.24mg/L,此时降解过程基本上结束,之后溶液中的NO3−-N浓度保持在1mg/L左右。在反应初期,溶液中的DOC呈上升趋势,3~5h内急剧上升,增长速率为42.21mg/(L·h),5h时达到一个峰值110.99mg/L后,又在2小时内迅速下降到28.62mg/L。此后,DOC持续上升,24h时DOC浓度升高至136.13mg/L,与7h时相比,浓度上升107.51mg/L。从图3(b)可以看出,用W14号反硝化纯菌接种的摇床2号反应体系完成整个系统的反硝化脱氮用时7h,7h时溶液中NO3−-N浓