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NHXXXXXX_species转录组生物信息分析结题报告转录组生物信息分析结题报告建库测序流程TotalRNA样品检测文库构建库检上机测序生物信息分析流程结果展示及说明原始序列数据测序数据质量评估参考序列比对分析可变剪切分析新转录本预测SNP和InDel分析基因表达水平分析RNA-seq整体质量评估基因差异表达分析差异基因GO富集分析差异基因KEGG富集分析差异基因蛋白互作网络分析参考文献附录文件目录列表软件列表Methods英文版备注1/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司一、建库测序流程一、建库测序流程从RNA样品到最终数据获得，样品检测、建库、测序每一个环节都会对数据质量和数量产生影响，而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果。为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性，诺禾致源对样品检测、建库、测序每一个生产步骤都严格把控，从根本上确保了高质量数据的产出。流程图如下：2/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司1TotalRNA样品检测样品检测诺禾致源对RNA样品的检测主要包括4种方法：(1)琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染(2)Nanodrop检测RNA的纯度（OD260/280比值）(3)Qubit对RNA浓度进行精确定量(4)Agilent2100精确检测RNA的完整性2文库构建文库构建样品检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则通过试剂盒去除rRNA来富集mRNA）。随后加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（randomhexamers）合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNApolymeraseI合成二链cDNA，随后利用AMPureXPbeads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXPbeads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。构建原理图如下：3库检库检文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent2100对文库的insertsize进行检测，insertsize符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞2nM），以保证文库质量。4上机测序上机测序库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq/MiSeq测序。3/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司二、生物信息分析流程二、生物信息分析流程获得原始测序序列(SequencedReads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析：其中，DEU分析仅针对有生物学重复样品，若样品无生物学重复，则不进行此项分析。对于蛋白互作网络分析，若其存在于合同信息分析内容中，而且选择了相应的分析物种或者近缘物种，则进行此项分析；若不存在，则不进行。4/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司三、结果展示及说明三、结果展示及说明1 原始序列数据 原始序列数据高通量测序(如IlluminaHiSeqTM2500/MiseqTM)得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(BaseCalling)分析转化为原始测序序列（SequencedReads），我们称之为RawData或RawReads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列（reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：@HWI-ST1276:71:C1162ACXX:1:1101:1208:24581:N:0:CGATGTNAAGAACACGTTCGGTCACCTCAGCACACTTGTGAATGTCATGGGATCCAT+#55???BBBBB?BA@DEEFFCFFHHFFCFFHHHHHHHFAE0ECFFD/AEHH其中第一行以“@”开头，随后为Illumina测序标识符(SequenceIdentifiers)和描述文字(选择性部分)；第二行是碱基序列；第三行以“+”开头，随后为Illumina测序标识符(选择性部分)；第四行是对应碱基的测序质量，该行中每个字符对应的ASCII值减去33，即为对应第二行碱基的测序质量值。Illumina测序标识符详细信息如下：HWI-ST1276Instrument–uniqueidentifierofthesequencer71runnumber–RunnumberoninstrumentC1162ACXXFlowCellID–IDofflowcell1LaneNumber–positiveinteger1101TileNumber–positiveinteger1208X–xcoordinateofthespot.Integerwhichcanbenegative2458Y–ycoordinateofthespot.Integerwhichcanbenegative1ReadNumber-1forsinglereads;1or2forpairedendsNwhetheritisfiltered-NB：Yifthereadisfilteredout,notinthedeliveredfastqfile,Notherwise0controlnumber-0whennoneofthecontrolbitsareon,otherwiseitisanevennumberCGATGTIlluminaindexsequences5/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司2 测序数据质量评估 测序数据质量评估2.1 测序错误率分布检查 测序错误率分布检查每个碱基测序错误率是通过测序Phred数值(Phredscore,Qphred)通过公式（公式1：Qphred=-10log10(e)）转化得到，而Phred数值是在碱基识别(BaseCalling)过程中通过一种概率模型计算得到，这种模型可以准确地预测碱基判别的错误率。Phred分值，不正确的碱基识别率，碱基正确识别率以及Q-score的对应关系如下表所显示：illuminaCasava1.8版本碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系Phred分值分值不正确的碱基识别不正确的碱基识别碱基正确识别率碱基正确识别率Q-sorce101/1090%Q10201/10099%Q20301/100099.9%Q30401/1000099.99%Q40测序错误率与碱基质量有关，受测序仪本身、测序试剂、样品等多个因素共同影响。对于RNA-seq技术，测序错误率分布具有两个特点：(1)测序错误率会随着测序序列(SequencedReads)长度的增加而升高，这是由于测序过程中化学试剂的消耗导致的，并且为illumina高通量测序平台都具有的特征。(2)前6个碱基的位置也会发生较高的测序错误率，而这个长度也正好等于在RNA-seq建库过程中反转录所需要的随机引物的长度。所以前6个碱基测序错误率较高的原因为随机引物和RNA模版的不完全结合(Jiangetal.)。图1 测序错误率分布图横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基错误率6/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司2.2 A/T/G/C含量分布检查含量分布检查GC含量分布检查用于检测有无AT、GC分离现象，而这种现象可能是测序或者建库所带来的，并且会影响后续的定量分析。在illumina测序平台的转录组测序中，反转录成cDNA时所用的6bp的随机引物会引起前几个位置的核苷酸组成存在一定的偏好性。而这种偏好性与测序的物种和实验室环境无关，但会影响转录组测序的均一性程度(Hansenetal.)。除此之外，理论上普通文库的G和C碱基及A和T碱基含量每个测序循环上应分别相等，且整个测序过程稳定不变，呈水平线，而对于链特异性建库会出现GC分离的现象。对于DGE测序来说，由于随机引物扩增偏差等原因，常常会导致在测序得到的每个read前6-7个碱基有较大的波动，这种波动属于正常情况。图2 GC含量分布图横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基所占的比例；不同颜色代表不同的碱基类型7/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司2.3 测序数据过滤 测序数据过滤测序得到的原始测序序列，里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，必须对rawreads进行过滤，得到cleanreads，后续分析都基于cleanreads。数据处理的步骤如下：(1)去除带接头(adapter)的reads；(2)去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10%的reads；(3)去除低质量reads(质量值sQ=5的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)。RNA-seq的接头(Adapter,OligonucleotidesequencesforTruSeqTMRNAandDNASamplePrepKits)信息：RNA5’Adapter(RA5),part#15013205：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’RNA3’Adapter(RA3),part#15013207：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(6位index)ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’图2.3 原始数据组成不同颜色的比例分别代表不同成分比例(1)Adapterrelated：因有接头，过滤掉的reads数及其占总rawreads数的比例。(2)ContainingN：因N含量超过10%，过滤掉的reads数及其占总rawreads数的比例。(3)Lowquality：因低质量，过滤掉的reads数及其占总rawreads数的比例。(4)Cleanreads：最终得到的cleanreads数及其占总rawreads数的比例。8/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司2.4 测序数据质量情况汇总 测序数据质量情况汇总样品测序产出数据质量评估情况详见表表1。表1 数据产出质量情况一览表SamplenameRawreadsCleanreadsCleanbasesErrorrate(%)Q20(%)Q30(%)GCcontent(%)sampleA1_134200519334833964.19G0.0395.6191.3248.43sampleA1_234200519334833964.19G0.0494.1389.0748.47sampleA2_134245266331053654.14G0.0395.8891.8748.42sampleA2_234245266331053654.14G0.0493.9888.8448.44sampleB1_132687612313616593.92G0.0395.9091.8849.30sampleB1_232687612313616593.92G0.0494.2389.2449.30sampleB2_130232747292372673.65G0.0395.9291.9248.87sampleB2_230232747292372673.65G0.0494.0588.9448.88sampleC1_128782461283694583.55G0.0395.9591.9848.57sampleC1_228782461283694583.55G0.0494.3989.5048.57sampleC2_128521158280358773.5G0.0395.9492.0047.72sampleC2_228521158280358773.5G0.0494.2889.3847.72数据质量情况详细内容如下：(1)Samplename：样品名，1为左端reads，2为右端reads。样品的cleanreads总数为左端+右端