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第三章高效有机物降解菌的构建技术及策略第三章高效有机物降解菌的构建技术及策略第一节高效有机物降解菌的构建技术一、传统分离及驯化技术二、诱变技术三、细胞融合技术四、基因重组技术五、基因工程第三章高效有机物降解菌的构建技术和策略第二节高效有机物降解菌的构建策略一、优化污染物的降解途径1.重组互补代谢途径2.改变污染物代谢产物流向3.同源基因体外随机拼接4.拓宽氧化酶的专一性二、提高污染物生物可利用性1.重组表面活性剂编码基因2.重组污染物跨膜转运基因三、增强细菌的环境适应性1.增强细菌的抗毒能力2.增强细菌的放射线耐受性第一节高效有机物降解菌的构建技术一、传统分离及驯化技术不经人工诱变，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育或自然分离。微生物自然突变有两种原因：(1)自然环境中存在的低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低浓度的诱变物质和微生物自身代谢产生诱变物质的作用引起的突变；（2）在DNA的复制过程中所发生的错配。一、传统分离及驯化技术来源：土壤、水、空气、动植物极其腐败残体、有机物污染地区、污水处理系统中。采样增殖培养纯种分离筛选性能鉴定一、传统分离及驯化技术采样：应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征极其生态关系等因素，确定具体时间、地点和目标物。增殖：为提高分离效率，常以投其所好的原则在培养基中添加特殊的养分，使其所需菌种的数量相对增加。主要是利用不同微生物的生长繁殖对环境和培养基的特殊要求进行富集培养和要求，控制这些条件使之有利于某类和某种微生物，而对其它微生物不利，再对培养时间加以控制，可以达到初步的分离和富集目的。一、传统分离及驯化技术纯化：1.菌落纯2.菌株纯1.菌落纯：从“种”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法、涂布分离法和稀释分离法。2.菌株纯：较为精细的单孢子或单细胞分离法。性能鉴定：菌的生长情况、酶活测定、效果测定自然选育是一种简便易行的选育方法。但自然选育的效率低（10-8—10-10）。二、诱变育种诱变育种是人为地利用物理、化学等因素，使诱变的细胞内遗传物质染色体或DNA的片段发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或DNA的某一部位发生改变(又称点突变)，从而使微生物的遗传物质DNA或其化学结构发生变化，引起微生物的遗传变异。因此，诱发突变的频率远大于自然突变。诱变过程出发菌株的选择：1.选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响；2.不仅效果好，而且要考虑其它形状，如生长快、营养要求低等；3.对诱变剂敏感的菌株；4.选择已经诱变过的菌株。诱变剂的选择（物理：紫外线、X射线等，化学：碱基类似物，5-氟尿嘧啶；烷化剂，亚硝基胍，甲基磺酸乙酯）要考虑诱变剂本身的特点，如紫外线作用于DNA分子的嘧啶碱基，而亚硝酸主要作用于DNA分子的嘌呤碱基，两者复合使用，突变谱宽，效果较好。诱变过程影响诱变效果的因素：菌种的生理状态：对分裂中的细胞更有效；细胞悬浮液要求生理状态一致，为分散均匀的单细胞或单孢子悬浮液（一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，另一方面可避免长出不纯菌落）。诱变过程诱变剂的剂量：诱变率随诱变剂量的增加而提高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降，使负变异株多，因此，主张用中等剂量，如75%-80%或更低剂量。充分利用复合处理的协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可以用同一诱变剂重复使用。复合处理可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大。筛选过程特点：发生频率低；随机性大过程：先初筛，后复筛，测突变菌株性能诱变育种的基本筛选程序：出发菌株→绝大多数个体死亡，少数存活（存活率）→少数突变（突变率）→少数正变（正变率）→少数降解酶活增加幅度大（增加率）且要求稳定三.原生质体融合原生质体融合(Protoplastfusion)指在一定选择条件下，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子。始于1976年，最早是在动物实验中发现的，后来早微生物中得以应用。使细胞间基因重组的频率大大提高了，已大于10-1（而诱变育种一般仅为10-6）。发生基因重组亲本的选择范围更大，可以在不同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进行。三.原生质体融合在有些情况下，两种或多种微生物在共同存在时才能降解某种污染物，单独存在时不能降解该污染物，这可能是因为彼此为对方提供了生长所必须的条件或为对方消除了生长的障碍，使得它们在共存的条件下能够顺利降解环境污染物。在这种情况下，可以采用原生质体融合技术融合这两种微生物，融合子就会具备两个亲本的基因与优点，能够降解某种环境污染物，这也是目前污染治理工程菌制备的一个主要途径。三.原生质体融合原生质体融合特点：1杂交频率较高2遗传物质体传递更为完整3存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能4提高效果的潜力较大三.原生质体融合3.1选择亲株：必须选遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株，而且必须带有可以识别的遗传标记（多为营养缺陷型或抗药性标记）。3.2原生质体制备：去除细胞壁是制备原生质体的关键，一般采用酶解法去壁。多酶混合除壁效果较好。影响因素：菌体前处理、菌龄、酶浓度、酶处理温度、PH、渗透压稳定剂（不仅起保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合。原生质体对渗透压极其敏感，低渗引起细胞破裂。多采用甘露醇、山梨醇、蔗糖等有机物和氯化钾和氯化钠等无机物。稳定剂的浓度一般均在0.3-0.8mol/L之间。三.原生质体融合3.3原生质体融合：融合促进剂：聚乙二醇（PEG，浓度为25%－40%）可有效促进原生质体融合。另外，紫外线照射和脉冲电场等物理因素处理也能促进原生质体融合。3.4原生质体再生：是使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。可再生的只占原生质体的一部分，细菌再生率为3%~10%；真菌为20%~80%。用再生培养基。提高再生率必须避免因强力动作而使原生质体破裂，另外菌液浓度不宜太高。菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间、细胞壁去除程度等因素都会影响再生。三.原生质体融合3.5筛选优良性状融合重组子：原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代成为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。（真正的融合和暂时的融合）融合子生理生化测定。原生质体技术还可用于诱变育种中。四、基因重组技术1.转化受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，再经复制就使自己变成一个转化子。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象。能进行转化的受体细胞必须处于感受态（受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态）。感受态因子是一种胞外蛋白。可能是细胞膜上的一种组成，催化DNA吸收据推测可能是一种自溶酶1.转化转化因子本质：DNA大小：占细菌核染色体组的0.3%，含15个基因。转化频率：0.1%~1%，最高达10%。呈质粒形式的转化因子，其转化频率最高，因为它进入受体菌后，可不必同受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达，一般认为转化因子都是线状双链DNA。过程：1）双链DNA片段与感受态受体细胞表面的特异位点结合；2）在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成片段；3）一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞；4）DNA片段与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，交换、整合和取代，形成杂合DNA片段；5）受体菌染色体复制，一个为转化子，一个不是。1.转化2.转导通过转导噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。2.传导通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的传导现象。完全缺陷噬菌体：当噬菌体在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数噬菌体的衣壳与噬菌体头部DNA芯子相仿的一小段供体菌DNA片段误包入其中，形成了一个不含噬菌体自身DNA的假噬菌体。进行完全普遍传导和流产普遍传导2.传导完全普遍传导：完全缺陷噬菌体将外源DNA导入受体细胞，该片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，再经过双交换而整合到受体菌染色体组上，使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。流产普遍传导：经转导而获得的供体菌DNA片段的受体菌，如果外源DNA在其内不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、翻译和性状表达。3、接合供体菌（雄）通过其性菌毛与受体菌（雌）相接触，前者传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。F因子：决定性别的质粒五.基因工程技术基因工程是分子水平上在生物体外用人工方法进行ＤＮＡ的重组，以改变生物的性状创造生物的新品种或新物种的一门新学科。对于环境中难以降解的有毒有害化合物，可通过基因工程的方法，设计新的代谢途径，利用相关的基因构建工程菌。这样不仅提高细胞单一酶的浓度增加代谢途径中某一限制酶的表达，还能使代谢途径中所有基因的表达获得同步增加，从而大大提高降解效率，促使有毒化合物分子进一步降解为无害的末端产物。五.基因工程主要过程：获得特定的目标基因目标基因片段DNA重组载体DNA进入受体细胞并扩增、表达具目标基因表达功能重组体黏性末端黏性末端1、限制性核酸内切酶限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，一种限制性内切酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（切割DNA分子）来源：主要从原核细胞分离作用：作用结果：EcoRI基因工程的“专用工具”平未端及粘性未端•什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。•要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。•如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。基因的针线：DNA连接酶GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG同种限制酶切割•基因的针线——DNA连接酶DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来(形成磷酸二酯键)，这样一个重组的DNA分子就形成了。导入过程需要运输工具——运载体。•运载体的作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去。作用二：利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。（一）载体基因克隆载体条件：（1）具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。（2）能携带外源DNA进入受体细胞或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随DNA复制而复制。（3）必须具有遗传标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。常用的运载体主要有两类：1）质粒2）噬菌体或某些动植物病毒质粒1.质粒的定义：一般来说符合以下3条标准的染色体外的DNA或RNA分子都可以称之为质粒：(1)质粒是染色体外能自主复制的遗传因子；(2)不具备胞外期的感染性；(3)它对宿主来说不是必需的。构建质粒载体一般选用分子小和松弛型复制的质粒。松弛型质粒在宿主细胞内可含10－200个拷贝，而且不受宿主细胞蛋白质合成的影响，当宿主细胞蛋白质合成停止时，质粒DNA的复制仍可以继续进行，甚至可以将拷贝数增加至数千个。细菌对环境中的特异性限制因子的应答能力一般是由质粒控制的，因此，质粒在为宿主细胞提供遗传多样性及其利用大范围生态位的适应中起着非常重要的作用。•大肠杆菌的质粒：最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如抗四环素