高效液相色谱法2

第四节固定相(stationaryphase)又称为填充剂、填料是高效液相色谱法的关键组成部分，它直接关系到柱效与分高度。(一)液固色谱固定相具有吸附活性的吸附剂。常用的有硅胶、氧化铝及高分子多孔微球(有机胶)，其次还有分子筛及聚酰胺等。硅胶分为表孔硅胶、无定形全多孔硅胶、球形全多孔硅胶及堆积硅珠等类型(图21－5)。因表孔硅胶的粒度大、柱效低，已淘汰，只介绍其余三种。图21－5各种类型硅胶示意图a表孔硅胶b无定形全多孔硅胶c球形全多孔硅胶d堆积硅珠(1)无定形全多孔硅胶国内代号YWG(Y液、W无、G硅)：近似球形(图21－5b)，粒径一般为5～10mm。理论塔板数可达每米5万～2万左右。YWG载样量大，可作为分析型柱与制备型柱的固定相，还可作为载体使用。价格便宜、柱效高及载样量大是其优点，涡流扩散项大及柱渗透性差是其缺点。(2)球形全多孔硅胶国内代号YQG(Q球)：常用粒径3～10mm。YQG除具有YWG的优点外，还具有涡流扩散项小及渗透性好等优点。3mm品，柱效可达每米8万。(3)堆积硅珠国内代号YQG(Q球)：是二氧化硅溶胶加凝结剂，聚结而成。堆积硅珠亦属全多孔型，与球形全多孔硅胶类似，粒径3～5mm，理论塔板数可达每米8万，传质阻抗小，样品容量大，也是一种较好的高效填料。硅胶是应用较广的(正相)固定相，主要用于分离溶于有机溶剂的极性至弱极性的分子型化合物(参考亲合力序)。也可用于分离某些几何异构体，但不如氧化铝。2．高分子多孔微球(YSG)也称有机胶。常用的有机胶是由苯乙烯与二乙烯苯交联而成，如日立3010胶。该固定相可用于分离芳烃、杂环甾体、生物碱、油溶性维生素、芳胺、酚、酯、醛、醚等化合物等。多数认为其分离机制属于吸附作用，也有认为是吸附、分配及空间排斥作用兼有。有机胶的表面为芳烃官能团，流动相为极性溶剂，相当于反相洗脱。这种固定相的柱效低(103m1)，但选择性好，峰形好。(二)化学键合相(Chemicallybondedphase)用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上，所形成的填料，简称键合相。键合相的优点：①使用过程官能团不流失，②化学性能稳定，在pH2～8的溶液中不变质，③热稳定性好，一般在70C以下稳定，④载样量大，比硅胶约高一个数量级，⑤适于作梯度洗脱。一般的化学键合相具有分配作用及一定的吸附作用，吸附作用的大小，视键合覆盖率而定。用化学反应方法将载体表面上残存的硅醇基除去，称为封尾、封顶或遮盖(end-capping)，所形成键合相称为封尾键合相。这种键合相没有吸附作用，强疏水是其缺点。化学键合相在高效液相色谱法中占有极重要的地位。目前多用SiOSiC(硅氧烷)型键合相。按极性可将其分为非极性、中等极性与极性三类。键合相的性质与键合官能团性质与链长、载体性质及表面覆盖度等有关。1．非极性键合相表面键合的基团为非极性烃基，如C18(octadecylsilyl，ODS)、C8、C1与苯基(可诱导极化)等。ODS键合相是最常用的非极性键合相。其键合反应简化如下：SiOH+ClSi(R2)C18H37SiOSi(R2)C18H37+HCl若上式的R2是两个甲基，则构成高碳ODS键合相。这种键合相载样量大、吸附性能也大。若R2是一个甲基，一个氯，氯与硅胶的另一个硅醇基再脱一分子HCl，则生成中碳ODS键合相。若R2是两个氯，与另二个硅醇基再脱二分子HCl，生成低碳ODS键合相。(l)载体性质：多数产品采用全多孔YWG、YQG或堆积硅球作为ODS键合相的载体。载体的比表面决定键合基团的总量，总量大，k大，保留时间长。涡流扩散项与柱渗透性，取决于载体的形状，以球形为好。按载体不同，区分为各种型号。国产品：YWG－C18H37，(5、10mm)、YQG－C18H37，(堆积硅珠，3~5mm)YWG－C6H5(5、10mm)等固定相代号的前部为载体，后部为官能团。进口品：NucleosilC18(球形，3或5mm)Partisil5ODS(无定形，5mm)等(2)表面覆盖度：在硅胶表面，每平方纳米约有6个硅醇基可供化学键合。由于键合基团的立体结构障碍，使这些硅酸基不能全部参加键合反应。参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例，称为该固定相的表面覆盖度。覆盖度的大小，决定键合相是分配，还是吸附占主导。Partisil－ODS的表面覆盖度为98％，即残存2％的硅醇基，分配占主导。Partisil10ODS的表面覆盖度为50％，既有分配又有吸附作用。封顶键合相只有分配作用，如国内产品YWG－FN是用氟酰胺遮盖了硅胶的一些吸附部位，分离效果良好，但疏水性强，在同样分离条件下，柱压高于普通键合相柱。(3)键合基团的链长：链长增加，极性降低，载样量增大、k值增大，例C18大于C8。ODS键合相最大允许载样量为每克固定相2103g。2．中等极性键合相常见的有醚基键合相(如YWG－ROR’)。这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。3．极性键合相常用氨基、氰基键合相。分别将氨丙硅烷基[Si(CH3)2NH2]及氰乙硅烷基[Si(CH3)2CN]键合在硅胶上而制成。它们可用作正相色谱的固定相。氨基键合相是分析糖类最常用固定相，常用乙腈一水为流动相，而不用烷烃，因为糖不溶解于烷烃。(三)其它固定相1．离子交换剂•离子交换树脂基本上已被键合型离子交换剂所替代。•键合型离子交换剂是以全多孔球形或无定型硅胶为基体，表面经化学键合上所需的离子交换基团。可分为强碱、弱碱或强酸、弱酸性离子交换剂。IEC常用的固定相有强酸性磺酸型(SO3H)阳离子键合相和强碱性季铵盐型(NR3Cl)阴离子键合相。还有含羧酸基或酚羟基的弱酸性阳离子交换剂等。以全多孔硅胶为基体的键合型离子交换剂的柱效高，载样量大。这类固定相具有较高的耐压性、化学和热稳定性好，可以用高压匀浆法装柱。但它在pH＞9的流动相中，硅胶容易溶解，未键合的残留硅羟基容易生成硅酸盐。因此，其适用范围只能在pH0～8。对上述键合固定相来说，在色谱过程中，流动相的pH，离子强度对被测组分的容量因子和分配系数有很大影响。因此，都用一定pH值和一定浓度的缓冲液，并严格控制其离子强度。交换容量全多孔微粒型键合相的交换容量(概念见第19章)一般在毫摩尔／克水平。当其它条件固定时，柱交换容量大，保留时间长。国产键合型离子交换剂有YWG(或YQG)SO3H、YWG(或YQG)NR3Cl等。2．凝胶SEC，GPE或GFC所用的固定相，是具有一定孔径范围的多孔凝胶。根据耐压程度，凝胶可分以下三种。•软质凝胶(如葡聚糖等)在压强0.1MPa左右即被压坏，因此这类凝胶只能用于常压下的凝胶色谱法。•半硬质凝胶由苯乙烯和二乙烯苯交联的聚合物，能耐较高的压力，可用作以有机溶剂为流动相的高效凝胶渗透色谱法的填料。这种凝胶的优点是具有可压缩性，能填得紧密，柱效高。缺点是在有机溶媒中具有膨胀性，当流动相流经时，随时改变着柱的填充状态。国产品如NGS01～08系列。•硬质凝胶硬质凝胶可分为多孔硅胶及多孔玻璃珠等种类。其优点是在溶剂中不变形，孔径尺寸固定，溶剂互换性好。其缺点是装柱时较易碎，不易装紧，因此柱效较差，一般为有机凝胶柱效的1/3～l/4。它的吸附性较强，有时易拖尾。国产硬质凝胶，如多孔硅珠NDG1～6等。凝胶的分离作用类似于分子筛。在选用凝胶时，必须注意凝胶的分子量排斥极限(分子量范围上限)及平均孔径等参数。使样品的分子量小于凝胶的分子量排斥极限并大于全渗透点的分子量，即落入凝胶的“分子量范围”。否则，(或VR)将不随分子量而变化。由于凝胶性能的分子量排斥极限与分子量范围等参数，是用一定的标准样品测得。如NDG－1分子量排斥极限为4104，是用聚乙烯标样测得。因此，不能将此参数直接套用于其它高分子样品。在测其它样品时，可参考凝胶的平均孔径，使样品分子线团的平均尺寸略小于凝胶的平均孔径。对于无法估计样品的分子尺寸与平均分子量时，可采用尝试法，用一系列凝胶柱测定，选出适宜的凝胶柱。3．手性固定相(chiralstationaryphase；CSP)•合成手性固定相将手性官能团键合在载体上而形成。合成手性固定相有p氢键型、配体交换型及蛋白质键合相等类别。p氢键型手性固定相是将具有光学活性的有机小分子通过间隔基键合到硅胶上而制得，以Pirkle型CSP应用最广泛，已发展至第三代产品。一般是CSP与相反构型的样品对映体作用力强。•天然手性固定相将天然手性物质(环糊精及如微晶纤维素三乙酸酯等纤维素衍生物)固着在载体(常用硅胶)上而构成。环糊精还可作为手性添加剂加到流动相中，分离几何异构体与对映体。4．亲合色谱固定相由配基与载体构成。配基有生物专一性配基及基团亲合配基等类别。生物专一性相互作用的体系，如抗原抗体、酶底物、酶抑制物及激素受体等的任一方都可作为另一方的配基。硅胶、交联琼脂糖凝胶及聚丙烯酸胺凝胶是常用载体。对于小分子配基，由于离载体表面太近，易受载体空间障碍的影响，而丧失亲合力，因此需在配基与载体间引入适当长度的间隔臂。第五节流动相(mobilephase，溶剂系统)在液相色谱法中，固定相一定时，流动相的种类、配比能严重影响分离效果，因此在HPLC中，流动相的选择至关重要，但凝胶色谱法除外。因为凝胶色谱法的分配系数(渗透系数)K只决定于凝胶的孔径与被分离高分子的分子线团尺寸，而与流动相的性质无关，流动相是样品的良溶剂即可。溶剂系统对分离度的影响，可用分离方程式(21·10)说明：(21·10)式中各符号含义同气相色谱章。11422kknR虽然分配系数比a与容量因子k关联，但与在GC中不同，而在HPLC中，a主要受溶剂种类的影响；k主要受溶剂的配比所左右。因为选择不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，有可能使两个被分离组分的分配系数不等，使a增大。在溶剂系统组成一定时，改变溶剂的配比，洗脱能力改变，k改变。由此可见，选择溶剂系统是以能获得较大的a与适宜的k值，而使k与tR合乎要求为目的。HPLC对流动相的基本要求：①不与固定相发生化学反应②对样品有适宜的溶解度，k在1～10(可用范围)或2～5(最佳范围)内。k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀③必须与检测器相适应④粘度小。(一)Snyder溶剂分类法可用于液相色谱的溶剂有80余种，了解分类有利于合理选择流动相。样品组分、溶剂与固定相三者间的作用力为分子间作用力，组分的分配系数由三者的分子间作用力所决定。Snyder选了三个参考物质，用于检验溶剂的三种分子间作用力，分别用Xe、Xd及Xn表述。并将81种色谱常用溶剂，按Xe、Xd及Xn在三角形坐标图上的相邻关系分为八类(组)。表21－2参考物与被检溶剂间的作用力关系参考物乙醇二氧六环硝基甲烷质子给予体质子受体强偶极分子被检溶剂质子受体作用力质子给予作用力强偶极作用力作用力类型(Xe)(Xd)(Xn)选择上述三个参考物，测定、计算出常用溶剂的极性参数P’值列于表213。表21－3常用溶剂的极性参数P’与分子间作用力溶剂P’XeXdXn溶剂P’XeXdXn正戊烷0.0乙醇4.30.520.190.29正己烷0.1乙酸乙酯4.40.340.230.43苯2.70.230.320.45丙酮5.10.350.350.42乙醚2.80.530.130.34甲醇5.10.480.480.31二氯甲烷3.10.290.180.53乙腈5.80.310.310.42正丙醇4.00.530.210.26乙酸6.00.390.390.30四氢呋喃4.00.380.200.42水10.20.370.370.25氯仿4.00.250.410.33表中的P’代表在正相色谱与硅胶吸附色谱法中溶剂的极性。P’大，洗脱能力大。Xe、Xd及Xn为三种作用力的相对值，三者之和为1。其数值的大小，表示作用力的强弱。将81种溶剂的Xe、Xd及Xn值，按其数值，点在三角坐标纸的相应位置上。将相邻溶剂圈成一组，共分为8组，称为溶