高效液相色谱法3

第七节定性、定量分析方法及应用与示例一、定性分析方法HPLC的定性方法可为色谱及非色谱鉴定法两类。1.色谱鉴定法利用纯物质和样品的保留时间或相对保留时间相互对照，进行定性分析，方法虽简单粗糙，但仍是已知范围未知物常用的鉴定方法。2.化学鉴定法利用专属性化学反应对分离后收集的组分定性。由于用HPLC收集组分比GC容易，因此该法是较实用的方法之一。官能团鉴定试剂与气相色谱的官能团试剂相同。3.结合色谱分离与质谱或光谱的鉴定法(1)离线色谱分离质谱或光谱鉴定方法：把HPLC作为分离手段，制备纯组分，而后用光谱仪器鉴定。要求分离度足够大。IR与MS需样量约1mg，NMR需样量较大，一般需3mg以上，太少需增加累加次数。(2)联用仪将高效液相色谱仪与光谱仪(或质谱仪)用界面联接成一个完整仪器，实现在线检测，称为联用仪。两谱联用仪能给出样品的色谱图，并能快速给出每个色谱组分的光谱(或质谱)图，能同时获得定性、定量信息。是当今成分复杂样品分析、鉴定的最重要手段。最常见的是HPLCUV联用仪，它能给出HPLCDADUV三维谱，但定性效果一般。HPLCMS联用仪是当前天然药物成分、药理与临床研究的最重要的联用仪器，但接口技术是关键，电喷雾界面是当前较理想的接口。大气压化学电离离子源，也是HPLCMS联用仪常用的离子源。二、定量分析方法液相色谱法的定量方法与气相色谱法相同。在液相色谱分析中，较少使用校正归一化法。常用外标法及内标对比法等进行定量分析。1.外标法以待测组分的纯品作对照物质，对比求算试样含量的方法。外标法可分为•外标工作曲线法•外标一点法•外标二点法等。优点：不需要知道校正因子，只要被测组分出峰、无干扰、保留时间适宜，就可进行定量分析。缺点：进样量必须准确，否则定量误差大。在HPLC中，因进样量较大(l0ml或以上)，而且用六通阀定量进样，进样量误差相对较小，因此外标法是HPLC常用定量方法之一。外标工作曲线法，常是用于检验线性范围及工作曲线是否通过原点。因为只有截距为零时，才能用外标一点法定量。在药物分析中，为了减小实验条件波动影响分析结果，采用随行外标一点法。即每次测定，都同时进对照品与样品溶液。2.内标法内标法分为工作曲线法内标一点法内标二点法内标对比法校正因子法在HPLC中最常用内标对比法。选择内标物的三个条件(纯、样品中不含有、保留时间接近)，在HPLC中的要求与GC完全一致。一般可选择一个化学结构与待测物质相似、物理性质相近的纯物质作为内标物，加到待测样品溶液中，经过样品前处理后进样。使用内标法可抵消因仪器稳定性差、进样量不够准确等原因带来的实验误差。(1)内标对比法：这种方法不需知校正因子又具有内标法的定量准确度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分析结果(含量)常用标示量％表示:(21.13)式中(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液中的量，W为平均片重(或丸重等)，m是取样量，其它符号的含义同GC章。若试样溶液与对照溶液中加人内标物的量相等，所称取的样品重与平均片重相同，则上式的后二项均等于1。%100//%mWmmAAAAsssisi对照样品对照样品标示量测定实例复方乙酸水杨酸片剂的含量测定(图21－17)。实验条件略对照溶液的配制按药典APC片剂处方(一片量)，精密称取阿司匹林(A)、非那西丁(P)、咖啡因(C)及扑热息痛(内标物)的对照品0.220、0.150、0.035及0.035g(ms)，放入100ml容量瓶中，用乙醇一氯仿(1:l)溶解，并稀释至刻度，备用。样品溶液(供试品溶液)的配制取5～10片的复方APC片剂，精密称定，求出平均片重W。将片剂研成细粉，取一片量的细粉，精密称定为m克。将此细粉用乙醇一氯仿(1:1)多次提取，过滤、滤液转移至100ml容量瓶(瓶内已放入精密称取的扑热息痛0.035g)中，洗涤沉淀，将洗涤液与滤液合并，稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液，备用。表21－6复方APC片剂各成分的平均峰面积(mV·s)ASPC对照溶液154856171222692272372221样品溶液178024202694820968407792W／m＝0.5010g／0.5012gl；(ms)样品=(ms)对照=0.035gA的标示量％=(178024／202694)(154856／171222)100％=97.l％P的标示量％=(820968／202694)(692272／171222)100％=100.l％C的标示量％=(407792／202694)(372221／171222)100％=92.5％若需计算A、P及C的在每片片剂中的含量mA、mP及mC，则将上述数据乘以A、P及C在处方中的含量即可:mA=97.1％0.220g=0.214g；mP=100.1％0.150g=0.150g；mP=92.5％0.035g=0.032g%100//%mWmmAAAAsssisi对照样品对照样品标示量(2)内标校正因子法：计算公式如式(20·43)所示。用此法需已知校正因子，而高效液相色谱法的校正因子很难由手册中查到，常常需自己测定。以APC为例，测定校正因子只需配制含有内标物及被测物纯品的标准溶液(对照溶液)，用上述完全相同的实验条件，进样5～10次，分别测定峰面积，代入第20章的式(20·37)，求得A、P及C的相对重量校正因子分别为7.01、1.07及0.44(实测20次的平均值)，可用表21－6的数据验算。自测的相对重量校正因子，只能在相同实验条件下使用，无通用性，需注意。多组分样品，各组分可互为参考物用叠加法测定含量。该法既具有内标对比法的特点，又不需要外加内标物，也是较实用的定量方法。siisssiiwswiwi''WAWAAWAWfff三、应用与示例高效液相色谱法主要用于复杂成分混合物的分离、定性与定量。由于HPLC分析样品的范围不受沸点、热稳定性、分子量大小及有机物与无机物的限制，一般说来只要能制成溶液就可分析，因此HPLC的分析范围远较GC广泛。对于药物分析工作者而言，主要用于各种有机混合物的分离分析，对纳克级水平以上的绝大多数有机物都能达到分离分析的目的。HPLC已广泛用于微量有机药物及中草药有效成分的分离、鉴定与含量测定。近年来，对体液中原型药物及其代谢产物的分离分析，无论在灵敏度、专属性及快速性等方面都有独特的优点，已成为体内药物分析、药理研究及临床检验的重要手段。高效液相色谱法是名符其实的高效微量分离、分析方法。(一)多环芳烃的分析(图21－18)多环芳烃的分析，可用反相或吸附色谱法分析。反相色谱法用ODS柱，用乙腈水或甲醇水为流动相。但用甲醇水时，保留时间较长，因此多采用梯度洗脱。多环芳烃也可用硅胶(YWG等)柱，以不含水的正己烷为流动相，也能获得较好的分离效果，但需注意溶解样品的溶剂应与流动相的性质相近。许多多环芳烃是致癌物质，其含量监测在食品分析与环境保护监测中都有实用意义。(二)蒽环类抗生素的分析(图21－19)蒽环类(anthracyclines)抗生素具有两个酚羟基，能与离子对试剂四丁基胺(TBA)磷酸盐结成中性离子对，因此可用反相离子对色谱法分析，方法简便。图21－19所示的流动相是甲醇一水(65:35)，其中加入10mmol／L的TBA磷酸盐。分离效果良好。(三)磺胺类药物的分析(图21－20)磺胺类药物显酸性，可用离子抑制色谱法分析。图21－20是11种磺胺类药物的混合物，用离子抑制色谱法分析的实例。举此例的另一目的是为了说明如何用三角形优化法选择反相色谱法的流动相。在第五节图21－9所标出的七组溶剂中，都加入1％的醋酸。依次作为流动相，检验分离效果。实验证明，第③号五元溶剂系统的分离效果最好，其组成是MeOHACNTHFH2OHAC(6.7:6.3:4.4:82.6:1.0)。(四)氨基酸的分析(图21－21)氨基酸的分析，一般多用衍生化法生成强荧光衍生物，用荧光检测器检测。图2121是使用最简便的OPA(邻苯二甲醛)衍生化法，此法虽较老，但仍很实用。图21－21OPA柱前衍生氨基酸的HPLC图样品:氨基酸标准品混合物色谱柱；YWGC18，10mm，4.6mm250mm流动相:溶剂A甲醇0.0lmol/L醋酸钠溶液(8:2，V/V)溶剂B甲醇0.0375mol/L柠檬酸钠溶液(2:8，V/V)梯度洗脱；B0％75％，45min荧光检测器:l1:334nm,l2:470nm第八节高效毛细管电泳法简介(Highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)电泳法是在30年代提出的依据带电粒子(离子或胶粒)在水相介质中受电场作用迁移速度的不同而分离分析的技术。至今，电泳技术仍在医学、生物化学和分子牛物学领域中大量用于分离分析多种生物大分子。经典电泳技术的缺点是效率较低、操作繁琐、再现性较差，特别是为了提高分离效率要加大电场强度，但由于电流产生焦尔热(Jouleheating)也随之加大，使谱带加宽，柱效明显降低。80年代中期，毛细管电泳技术的发明解决了这个问题。由于HPCE具有柱效高，分离速度快，样品量小，仪器简单，特别适用于氨基酸、多肽、蛋白质和核酸等生物分子的测定，顺应了人类发展生命科学的需要，因而自问世以来受到普遍重视。从目前的趋势看，高效毛细管电泳法将在近期得到更大的发展和更广泛的应用。一、基本原理HPCE技术和一般色谱技术主要的区别在于，其分离原理是基于在电场作用下离子迁移的速度不同对组分进行分离和分析。(一)仪器HPCE所用仪器主要由高压电源、毛细管、电解质贮液槽等部分组成(下图)。一根长约50～100cm，内径25～100mm的熔融毛细管柱，一端由进样装置吸入样品，一端与检测器连接，毛细管两端插入电解质贮液槽中，用高压电源外加约20～30kV的稳定电压。高效毛细管电泳使用的是空心毛细管柱，内壁不涂渍固定液，消除了流动相平衡所需要的时间，使传质阻抗项趋于零，则VanDeemter方程式的形式为:H=B／u因此，HPCE的理论塔片数可高至50000至500000。图21－22HPCE仪器示意图图21－23HPCE和HPLC柱效的比较样品:苯甲醇(二)电泳和电泳淌度通常物理学中用淌度(mobility)量度电场中离子的迁移速度。带电荷q(库)的离子置于场强为E(V／m)的电场中所受力为qE(牛)，而溶液中离于所受的摩擦力为fuep，这里uep是离子在电泳中的速度，下标ep表示电泳(electrophore-sis)，f是摩擦系数。因为在电场中有qE=fuep(21·14)+fuepqE++ion定义电泳淌度mep为离子迁移速度uep和场强E的比值，则有(21·15)离子迁移速度uep和场强E的量纲分别为mm／s和V／m，故电泳淌度mep的量纲为m2/(V·s)。从上式可知电泳淌度mep和离子电荷q成正比，和摩擦力系数f成反比。故对大小相近的分子，淌度mep随离子电荷量加大而增大。根据斯托克方程，半径为r的球形粒子的摩擦系数f有f=6phg(21·16)式中，h是溶液的粘度。因此，摩擦力系数f和带电荷分子的大小成正比，越大的分子淌度mep的绝对值越小。EEfquepepm(三)电渗和电渗淌度高效毛细管电泳法使用了熔融石英毛细管柱。其内壁覆盖着一层硅氧基(SiO)阴离子，由于吸引了溶液中的阳离子，由此在毛细管内壁形成表面带阴离子的双电层。双电层外缘扩散层中富集的阳离子被电场阴极吸引导致溶液向阴极的流动，这种效应称为电渗(electroosmosis，下图)。电渗流的速度ueo和电场强度E成正比，定义电渗速度ueo和场强E的比值为电渗淌度meo，即meo=ueo/E(20·17)电渗淌度和硅氧层表面的电荷密度成正比，和离子强度的平方根成反比。在低pH条件下，硅氧层形成分子(SiOH)，因而减少了表面电荷密度，故电渗速度减小。如在pH9的硼砂缓冲液中电渗速度