光散射技术在蛋白质表征领域的应用

光散射技术最新进展及其在生物医药领域的应用宁辉MalvernInstrument2015年纳米颗粒/蛋白尺寸及其分布zeta电位/稳定性绝对分子量相互作用力……光散射技术当激光与溶液/悬浮液中的大分子物质相遇？！SizeRg散射光光散射技术的应用应用涂层化学工业纳米技术生物/药物多糖疫苗诊断蛋白质特性药物释放DNA/基因疗法纳米钻石纳米银颗粒量子点色素/油漆油墨炭化分散体系高分子陶瓷表面活性剂微乳液高分子溶液二氧化硅分散体系内容›动态光散射及其粒径检测测量原理由相关曲线得到粒径信息–数据分析动态光散射功能扩展›电泳光散射及其Zeta电位检测›静态光散射及其绝对分子量检测粒径测量技术110100110100纳米微米0.11000SievesElectronmicroscopySedimentationDisccentrifugeLaserdiffractionElectrozonesensingAFM/STMetcDynamiclightscatteringAcousticspectroscopyMicroscopy光散射技术仪器系统激光盛放样品的样品池数字信号处理器(相关器)Correlate光电检测设备(APD)Time(s)Intensity(kcps)布朗运动的速度依赖于粒子的大小媒体的粘度ApplyAlgorithm颗粒运动速度，即扩散系数D（cm2/s）小颗粒布朗运动大颗粒布朗运动动态光散射动态光散射技术检测光强随时间的波动性行为从而计算出颗粒的扩散速度(D),并通过Stokes-Einstein方程得到颗粒的流体力学直径/半径(DH)k=Boltzmann’sconstant,T=absolutetemperature,=viscositykT3DHD=光强波动，相关函数和粒径分布CorrelateApplyAlgorithmTime(s)Intensity(kcps)SmallParticlesCorrelateApplyAlgorithmTime(s)Intensity(kcps)LargeParticles相关曲线相关曲线这里:G=Dq2为衰减率D为扩散系数q=(4n/lo)sin(q/2)为散射矢量n为折光指数lo为照射光波长q为散射角度对于单分散体系tAgGexp1)(3hdTkDBSTOKES-EINSTEINEQUATIONSTOKES-EINSTEINEQUATION光强,体积和数量分布-米式理论，输入颗粒的折光指数和吸收率数量分布光强分布(RayleighTheory)体积分布数量平均粒径28nmRelative%inclassDiameter(nm)55011N1:N2体积平均粒径49nmRelative%inclassDiameter(nm)55011,000N1*4/3πr13:N2*4/3πr23N1V1:N2V2光强平均粒径=50nmRelative%inclassDiameter(nm)5501,000,0001N1V12:N2V22设想一个由相等数量的5nm和50nm球型粒子组成的混合物MietheoryMietheory光强，体积和数量分布:例子Peak1Peak2Mean(nm)%Mean(nm)%Intensity23186.365.813.7Volume23250.361.849.7Number1842.658.297.460nm和220nm聚苯乙烯乳液标样1:1体积混合z-均直径=168nmPDI=0.215金颗粒MRK956-01›样品的颜色与金颗粒的大小和形态相关›通常使用电子显微镜计数表征纳米金颗粒›在显微镜下可以较好的分辨颗粒的形态，但是无法区分颗粒在溶液状态中是否聚集PhotographcourtesyofDr.Kandela,UniversityofWisconsinBBPIClabTakenfrom›光强分布BimodalSignificantaggregates›体积分布Opticalpropertiesusedwere0.2and3.32respectively90%bymassaresmallparticles›数量分布MonomodalComparabletoTEMresult抗原和抗体：例1加入抗体前/后蛋白质尺寸变化加入抗体后蛋白质尺寸随时间变化抗原和抗体：例2›图1显示了血清中一种抗体的三次重复测试.›在图2中我们分别混合两种不同的抗体和一种病毒，然后使用动态光散射测量体系的粒径，通过这种方法来判断这两种抗体的对病毒的亲和性›根据粒子尺寸增长的速率，我们可以得出结论：抗体1显示更高的亲和性.蛋白质的表征：pH临界点（使用自动滴定仪）在蛋白质中加入高分子可以形成高分子-蛋白质缔合物缔合物的形成取决于高分子的表面电荷，蛋白质的类型，离子强度等因素盐分对蛋白质稳定性影响：牛血清蛋白质（BSA）盐分的加入导致了静电屏蔽效应，增加了BSA聚集倾向内容›动态光散射及其粒径检测–ZetasizerNano›电泳光散射及其Zeta电位检测Zeta电位的起源和意义及其影响因素Zeta电位的测量原理表面电位的检测›静态光散射及其绝对分子量检测表面电荷的起源表面电荷的起源›大部分存在于水体系中的胶体颗粒携带电荷›关于表面电荷的产生，有很多种原因，依赖于粒子的表面性质和周围的媒体表面基团离子化有失去或者得到离子的趋势带电物质吸附在粒子表面维持系统稳定性:静电排斥作用高电位›颗粒间相互排斥力高›样品稳定低或者零电位›絮凝、团聚、沉淀›不稳定样品Zeta电位(ZetaPotential)什么是Zeta电位?Zeta电位同时依赖于粒子表面和分散剂的化学性质对于静电力稳定的分散体系，通常是Zeta电位越高，体系越稳定体系稳定与否通常以Zeta电位是否大于30mV为标准影响Zeta电位的因素影响Zeta电位的因素有：pH变化,电导率(浓度，盐的类型)组成成分浓度的变化(如高分子，表面活性剂){SternlayerSlippingplaneDiffuselayer--1000mVDistancefromparticlesurfaceSurfacepotentialSternpotentialZetapotentialParticlewithnegativesurfacechargepH值影响9234567811011121314pHZetaPotential(mV)0+30-30IsoelectricPoint离子强度›非特异性相互作用–不影响电中点›特异性相互作用–改变电中点位置AluminaAluminaZetasizerNano是如何测量zeta电位的?›样品的散射光和参考光源相干产生调制信号›频率分析得出粒子电泳运动速度›Zeta电位由Henry方程换算而得电泳光散射›一束激光穿照射在进行电泳运动的样品上，由于颗粒的电泳运动，散射光的频率发生偏移›频率的偏移f与电泳的速度相关:=粒子的电泳速度l=激光波长q=散射角f=2sin(/2)/电泳ELECTROPHORESIS电泳ELECTROPHORESISZeta电位可利用HENRYEQUATION由带电粒子电泳速度得到z=zeta电位UE=电泳速度e=介电常数粘度f(ka)=Henry’sfunction2ezf(ka)3UE=插入式样品池-有效检测有机相中颗粒的Zeta电位方法•有机溶液介电常数较小，电场低，电泳速度慢•新一代相分析光散射可以检测到最小10-12m2/V.s的电泳运动，是唯一的有效检测有机相中电位的方法碳黑在环己烷中自动滴定仪MPT-2autotitrator自动滴定仪可以进行以下滴定:pH电导率稀释(样品浓度)二氧化钛›TiO2有广泛的应用:色素,墨水和涂料食品,医药和化妆品高分子,纸张›有多种天然存在状态，伴随着不同的性质金红石/Rutile锐钛矿/Anatase板钛矿/BrookiteTiO2的pH滴定050010001500200025003456789Z-Average(d.nm)pH-30-20-10010203040ZetaPotential(mV)pHTitrationGraphpH5.83zetasize表面zeta电位›检测不溶于溶剂的材料表面的zeta电位样品尺寸5mm*3mm,1mm厚度›应用材料滤膜骨骼材料接触透镜蛋白相互作用›功能检测各种环境改变对于材料表面电荷的影响环境表面对于材料表面吸附造成的影响,如pH、盐浓度、环境组分的浓度改变ZEN1020表面zeta电位样品池›包括电极、样品池组件、专用工具原理›将样品粘贴在样品池基座上，插入到电极之间›加入带电示踪颗粒›检测示踪颗粒在距离表面不同位置的表面电泳速度分析›表面电位计算:通过外推，在截距位置的电位大小就是表面电位Distancefromsamplesurface-µmPTFE样品使用DTS1230作为示踪颗粒(pH9)内容›动态光散射及其粒径检测›电泳光散射及其Zeta电位检测›静态光散射及其绝对分子量检测单机静态光散射-平均绝对分子量–zetasizerNanoGPC光散射连用-绝对分子量及其分布–Viscotek小角光散射绝对分子量–单机静态光散射Staticlightscattering(SLS)›在静态光散射中，我们检测溶质粒子的绝对散射光强虽浓度的变化›在ZetasizerNanoZS中，我们在一个角度检测光强›通过Debye曲线我们可以测量小分子均匀散射条件下平均绝对分子量第二维利系数什么样的样品适合静态光散射?YESNOProteinsPolymersDendrimersLiposomesEmulsionsMixtures静态光散射I(MW2)(C)K：光学常数C：浓度M：分子量Rq：样品的瑞利比A2：2nd维利系数P(q)：形态因子(RayleighEquation)CAMRKC221样品制备›在适合的溶剂中，制备一系列已知准确浓度的样品样品溶液›具体浓度依赖于所测量的样品，一般在0.1-10g/L1234溶剂样品制备›所有使用的玻璃容器，吸液管，样品池，溶剂，均应无尘›用过滤膜过滤所有的溶剂，分散剂(e.g.WhatmanAnotop20nmporesizefilters)分子量测定应用实例(LysozymeinPBS)1/截距=14.6KDa斜率=-3.23x10-4绝对分子量–GPC/SEC连用静态光散射Staticlightscattering(SLS)›通过GPC/SEC进行样品分离›通过使用在线小角或者多角度光散射检测器检测每一个组分绝对分子量，RI检测器提供浓度信息›我们可以测量高分子/蛋白绝对分子量Mn、Mw、Mz及其分布第二维利系数分子大小–均方旋转半径小角在线光散射检测器多角在线光散射检测器TimeSequence(A)SampleInjected(B)SizeSeparation(C)LargeSolutesEluted(D)SmallSolutesElutedSolventFlowSampleMixturePorousPackagingChromatogram(ConcentrationElutionCurve)(A)(B)(C)(D)InjectionRetentionTimeConcentrationDetectorGPC柱子分离基于分子大小而不是分子量Mw和HPLC不同,GPC柱分离不需要化学相互作用GPC完全依赖于物理分离原理GPC/SEC-光散射连用GPC泵脱气机溶剂自动进样器进样环色谱柱装置废液回收低压力高压力示差信号1.00RI检测器1.00光散射检测器直角光散射信号小角光散射信号静态光散射原理w0K.c.M)R(•R(θ)istheexcessRayleig