工业废水毒性鉴定评价方法体系的建议及其应用示例赵建亮

生态环境学报2011,20(3):[e-mail]基金项目：国家科技重大专项“水体污染控制与治理”专项之“流域水污染源风险管理技术研究”课题(2008ZX07528-001)与“东江优控污染物动态控制管理技术体系研究与应用示范”课题（2008ZX07211-008）作者简介：赵建亮（1979年生），男，助理研究员，博士，主要从事污染物化学与生态毒理研究。E-mail:[e-mail]*通讯作者：应光国。Email:[e-mail]收稿日期：2011-02-22工业废水毒性鉴定评价方法体系的建议及其应用示例赵建亮，方怡向，应光国*中国科学院广州地球化学研究所//有机地球化学国家重点实验室，广东广州510640摘要：工业废水是自然环境中毒害污染物的主要来源，对其进行毒性鉴定和评价，是废水毒性管控的基础。我国目前仍缺乏规范的工业废水毒性鉴定和评价体系，本文针对这一状况，综述了美国环保局颁布的废水毒性鉴定评价(TIE)指南和欧盟采用的效应导向分析(EDA)方法，提出了结合TIE方法和EDA方法的优点建立工业废水毒性鉴定评价方法体系的建议，并选取珠三角地区电镀废水作为该体系的应用示例，采用发光菌和重组基因酵母菌进行快速毒性测试，并结合化学分析方法，确定电镀行业废水毒性主要来源于金属Cu和壬基酚聚氧乙烯醚类有机物。关键词：TIE；EDA；工业废水；毒性鉴定；毒性评价中图分类号：X824文献标志码：A文章编号：1674-5906（2011）03-0549-11各类工业废水一直以来是自然环境中毒害污染物的主要来源。目前，我国工业废水排放的监督和管理主要采用物理化学监测方法，根据理化指标进行评价、计算污染物等标污染负荷、及进行总量控制[1]。我国已制定并不断更新了一系列工业废水污染物排放标准，如纺织染整[2]、制浆造纸[3]、制药[4]、电镀[5]等行业，这些工业废水排放标准在经济发展过程中对水质保护起到了重要作用。然而，这些标准主要集中在化学需氧量、氨氮及少量污染物（如常见重金属）指标的控制上，所反映的只是废水中某一种或几种污染物的浓度水平及贡献量，并不能反映出废水对排放到自然环境中生物的综合毒性大小[6]。由于工业废水基质复杂，往往致毒物质并不一定都在监控范围之内[7-9]，因而有必要进行废水综合毒性测试，鉴定致毒物质，采取措施降低废水排放对生物及生态系统的影响。废水毒性鉴定评价是指利用一系列模式生物，采用标准化测试方法，以存活、生长发育等作为测试终点，判断废水综合毒性，通过毒性测试与物理化学处理相结合，确定废水有毒物质成分。发达国家或地区已先后建立了毒性鉴定评价方法、制定了废水排放的毒性标准，其中美国环保局(USEPA)的毒性鉴定评价(Toxicityidentificationevaluation,TIE)方法[10-12]昀为突出。而欧盟还发展了另一种毒性鉴定评价方法，即效应导向分析(Effect-directedanalysis,EDA)方法[13]。效应导向分析主要针对废水有机提取物，采用分级分馏与快速毒性测试相结合来甄别各种致毒物质。不过，我国目前仍没有工业废水毒性测试方法及毒性排放控制标准。本文详细综述了TIE和EDA两种毒性鉴定评价方法体系、并结合本研究小组对珠三角地区电镀行业废水进行TIE和EDA综合应用示例，探讨建立适合我国工业废水毒性测试的方法体系，为研究人员和环境决策提供参考。1废水TIE方法USEPA于上世纪90年代早期建立了废水TIE方法指南，主要目的是为指导企业减少废水毒性对环境中水生生物的危害，同时也是环境执法行动和美国国家污染物排放削减(NPDES)许可的基础。总体来说，TIE分为3个阶段：阶段Ⅰ为毒性表征[10,14]；阶段Ⅱ为毒性鉴定[11]；阶段Ⅲ为毒性确认[12]。TIE方法进行毒性鉴定的范围涵盖了氨氮、重金属离子等无机物和各类有机物[6]。主要采用活体生物测试，受试物种包括藻、浮萍、溞、鱼等不同营养级的模式生物。后来研究人员开发的发光菌方法，因其快速简便也得到了广泛应用[15-18]。1.1受试物种和测试终点选择由于不同物种对于同一致毒物具有不同的灵敏度，而同一物种对不同致毒物的敏感度差异也很大，因而在进行TIE前需明确我们需关注废水对何种生物的毒性。采用TIE方法进行废水毒性测试时，网纹溞(Ceriodaphniadubia)、大型溞(Daphniamagna)或蚤状溞(Daphniapulex)、呆鲦鱼(Pimephalespromelas)等生物是昀常用的测试物种[19-22]。TIE方法指南中推荐使用两种物种同时进行测试，如使用网纹溞和呆鲦鱼、网纹溞和大型溞、网纹溞和蚤状溞[10]。在TIE应用过程中，新月藻(Nitzschiaclosterium)[23]、卵叶青萍(Lemnagibba)[24]、鱼[25]及发光菌[18]也是研究人员常用受试物种，选取受试物种的原则是该物种具有足DOI:10.16258/j.cnki.1674-5906.2011.03.032550生态环境学报第20卷第3期（2011年3月）够的灵敏度检测废水毒性。生长发育(Growth)、繁殖力(Reproduction)和存活率(Survival)是废水毒性测试昀为常用的测试终点。对于急性毒性测试，一般以半效应浓度(LC50)或25%效应浓度(LC25)表示效应；对于慢性毒性测试，使用昀大观测无效应浓度(NOEC)或昀低观测效应浓度(LOEC)来表示毒性效应。毒性当量则以毒性单位(TU)表示[14]。对于急性毒性，废水的TU值为100%÷LC50，如某废水LC50为25%，则该废水TU值为4TU。对于慢性毒性，废水TU值为100%÷NOEC。化合物TU值的计算方法与之类似，如某化合物LC50为1mg·L-1，则含量为1mg·L-1的该化合物水溶液的TU数为2TU。在受试物种和受试时间相同的情况下，采用TU表示毒性大小，可以对废水毒性进行比较。毒性当量也是制定排水毒性标准的依据，美国废水排放毒性基准常定为：急性毒性0.3TU，慢性毒性1TU，因此毒性废水要经过一定稀释后再排放[14]。1.2毒性表征TIE的阶段Ⅰ是毒性表征。此阶段目的是对废水进行各种物理化学处理，通过对比处理前后毒性的变化，明确致毒物质的大致类型。阶段Ⅰ的操作流程如图1所示。物理化学处理主要包括：与pH调节相耦合的过滤、曝气和C18–SPE（固相萃取）、添加Na2S2O3和EDTA、及梯度调节pH。所对应的致毒物质类别主要可甄别为可滤性物质、可挥发性物质、非极性有机物、氧化性物质、重金属、及毒性随pH变化物质。TIE的阶段Ⅰ可快速、经济和有效地判断废水中存在致毒物质的理化特性和所属类别。在阶段Ⅰ，USEPA推荐使用网纹溞和呆鲦鱼幼鱼作为受试物种。由于该阶段主要为定性分析，因而在保证精度的情况下可设置较少的重复和测试体积。对于废水的稀释比例设定，一般采用6.25%、12.5%、25%、50%和100%的稀释梯度，若废水毒性较高，可进一步增加稀释倍数。受试废水溶液需每天更新，以保证毒性的一致性，经物化处理后废水的更新则要视情况而定。空白试验和毒性对照试验必须同时进行，以排除假阳性情况的发生。改变pH能够影响污染物的溶解性、极性、挥发性、稳定性和离子状态，甚至影响生物有效性。因而，pH值的变化往往带来废水毒性的重大变化，所以本阶段毒性测试过程往往伴随pH的调节，为致毒物质的判断提供更丰富信息。一般情况下，pH调节与过滤、曝气、C18–SPE等处理过程相结合，将pH分别调到pH3和pH11，经这些过程处理后，将pH调回原值(pHi)，然后进行毒性测试，并与基础毒性测试结果进行比较。一些水生生物（如溞、鱼）能够吞食微粒、细菌等颗粒物，并以之为食。pH调节/过滤处理则通过测试废水经pH调节与过滤处理后毒性的变化，辨别是否由颗粒物所含物质引起的毒性。pH可以改变致毒物质与颗粒相的作用强度，过滤前先将pH调至pH3和pH11，然后再将滤液调回pHi，进行前后毒性对比。USEPA推荐使用加压过滤，因为真空过滤可能损失挥发性致毒物质，不过真空过滤往往可作为加压过滤的对比试验，为判断毒性是否由挥发性物质引起提供依据。进一步弄清过滤去除毒性的机制（如沉淀、吸附、平衡常数变化、挥发等）有助于鉴定滤饼中所含的致毒物质。pH调节/曝气相结合的处理可以判断废水毒性是否由挥发性物质、表面活性剂或氧化性物质引起。由于pH会随曝气时间逐渐改变，因此需随时监测pH的变化，并调回设定值。通过比较pH3、pHi和pH11曝气前后的毒性变化，推断致毒物质种类。表面活性剂能结合在气泡表面，随气泡一起挥发出来，因此如果同步进行的空气曝气和氮气曝气引起的毒性降低幅度一致，那么毒性降低往往是由于表面活性类物质随气泡一起逸出所致。如果仅仅空气曝气引起毒性降低，那么毒性可能是由于氧化性物质引起。若废水毒图1TIE阶段Ⅰ流程图Fig.1FlowchartofPhaseITIE工业废水„毒性存在于颗粒物相？„毒性由挥发性物质引起？„毒性由非极性有机物引起？„毒性由氧化性物质引起？„毒性由金属引起？„致毒物随pH变化而变化？毒性测试基础毒性测试„pH调节/过滤；„pH调节/曝气；„pH调节/C18　SPE（固相萃取）；„加Na2S2O3；„加EDTA；„梯度调节pH。致毒物质类别赵建亮等：工业废水毒性鉴定评价方法体系的建议及其应用示例551性在pH=11条件下曝气后的降幅远高于pHi或pH=3条件下的降幅，则毒性很可能由氨引起。pH调节/C18–SPE相结合的处理可以判断由非极性有机物引起的毒性。将pH调到pH3和pH11（需考虑SPE柱对极酸和极碱的耐受性），然后200mL废水经C18–SPE（3mL吸附剂）后，柱后废水调回pHi，比较柱前柱后废水的毒性变化。若毒性在柱前柱后变化不大，那么致毒物质则不是非极性物质。若C18–SPE处理后降低了柱后废水毒性，则用1mL甲醇洗脱SPE柱富集的有机物，取150µL洗脱液稀释到10mL进行毒性测试。若测试结果表明甲醇洗脱液具有毒性，且柱后废水毒性降低，则表明毒性由非极性有机物引起，可通过阶段Ⅱ进一步鉴定SPE吸附的致毒物质。如果C18–SPE处理可降低废水毒性，而甲醇洗脱液没有毒性，则毒性可能是由表面活性剂引起。氧化还原处理是通过废水组分被Na2S2O3的还原情况判别致毒物质。氯气是水中常见的氧化性致毒物质，具有杀虫和氧化作用，对水生生物具有急性毒性，而慢性毒性则较弱。若加入Na2S2O3之后引起毒性降低，则可考虑毒性由氯气引起。不过Na2S2O3也可与阳离子金属结合，使废水毒性降低，因而需要与EDTA（乙二胺四乙酸）螯合处理过程一起判断致毒物质。如果加入EDTA与加入Na2S2O3引起的毒性降幅类似，则毒性可能是由阳离子金属引起。梯度pH处理是为了鉴定废水中是否存在随pH变化而变化的致毒物质。如前所述，由氨、金属、硫化氢等引起的毒性都能够随pH变化而变化。pH梯度的选择要视情况而定，梯度变化步长一般为1或0.5，并需考虑受试物种对pH的耐受性（一般在pH6~9）。在毒性测试过程中，保持pH恒定非常重要。如果毒性在pH低点昀高，并随pH升高毒性逐渐降低，那么毒性可能由NH3所致。不过，此步的测试结果往往需要与上述结果进行比较，以综合判断致毒物质类别。1.3毒性鉴定TIE的阶段Ⅱ是毒性鉴定。此阶段的目的是根据阶段Ⅰ的毒性特征，通过合适的分离和分析技术，鉴定出废水中特定的致毒物质。阶段Ⅱ的基本原则是寻找昀简便方法将混合的毒性物质与非毒性物质分开，逐步鉴定出致毒物质。一般情况下，如果致毒物质是由于金属、挥发性物质（NH3或Cl2）所致，则不必使用分离手段、而直接使用仪器分析其含量。如果毒性是由单个非极性有机物引起，而此物质又与其它非致毒物质一起存在，