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光合细菌PSB-B4的分离与培养条件优化研究摘要:利用光合细菌处理有机污水是当前污水生物处理中的一种新方法。通过筛选,从污水中分离得到一株生长较快、适应性较强的光合细菌菌株,标记为PSB-B4。通过菌落形态、培养特征和菌体形态学观察,细胞吸收光谱及生理生化特性测定,初步鉴定为类球红细菌(Rhodohactersphaeroides)。对这一光合细菌菌株的培养条件进行优化研究,最终确定菌株PSB-B4的最佳培养基配方及培养条件为:酵母膏2.0g,乙酸钠4.0g,氯化铵2.0g,蛋白胨3.0g,磷酸氢二钾0.2g,硫酸镁0.2g,氯化钠1.25g,碳酸氢钠1.0g,蒸馏水1000mL,pH=7.0,培养温度28e,光照强度4000Lux,其中酵母膏对其生长影响最大。关键词:类球红细菌;分离鉴定;培养条件0引言光合细菌(Photosyntheticbacteria,PSB)属于水圈微生物的一种,能充分利用光能和各种有机物作为营养源进行自身的营养繁殖。菌体本身无毒,含有多种营养物质和生命活性物质,具有调节微生态平衡、促进动植物生长、增加产量和提高质量等独特的生理功能。随着人们对光合细菌研究的不断深入,证明光合细菌在农业生产及有机污水处理方面均有很好的应用价值。利用光合细菌处理有机污水,是当前污水生物处理中的一个新的发展方向[1-3]。为了更有效地开发光合细菌这一尚未被充分的微生物资源,使之在有机污水生物处理中发挥更大的作用,本文从污水中分离得到一株适应性强、生长较快的光合细菌菌株,并对其进行了初步鉴定和培养条件优化研究。1材料与方法1.1材料取沈阳北部地区某农场污水池浅层污泥。1.2方法1)培养基选择红螺菌培养基[5]作为富集分离基础培养基,培养温度选择28e[6]。2)菌株的分离筛选方法取泥样10g装入150mL三角瓶中,加入富集培养液至满,并覆盖一层无菌液体石蜡,封口,在28e,3000~5000Lux光照条件下培养7~10d,至菌液颜色呈橙红色,取此富集培养液10mL,继续富集培养,重复以上操作2~3次,采用试管稀释培养法和双层平板培养法[7-8]对光合细菌进行分离纯化,选取生长较快的菌株作为出发菌株。3)活细胞吸收光谱的测定取纯培养物5.0mL,4000r#min-1离心5min,用无菌生理盐水洗涤,再离心、洗涤,反复3次,悬浮于60%蔗糖溶液中,采用紫外可见分光光度计扫描测定菌体,在波长范围300~1100nm的吸收光谱峰值。4)分离菌株鉴定的依据菌落形态观察、细胞形状观察、生理生化特性的测定参照文献[9-10]。5)初始pH值对分离菌生长的影响基础培养液配制pH=5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10,倒入同一规格的无菌试管中,加入1mL等量菌液,在28e,3500Lux条件下,光照厌氧培养7d后测定OD660值。6)不同光照强度对分离菌生长的影响基础培养液的pH值设置为7.0,灭菌后倒入同一规格无菌试管中,加入1mL等量菌液,在28e条件下,光照强度分别设为:1000,2000,3000,4000,5000Lux,光照厌氧培养7天后测定OD660值。7)培养基正交试验选择酵母膏、乙酸钠、氯化铵、蛋白胨、微量元素5个因子进行分析,设计5因素4水平的正交试验(表1)。培养基中其他成分:MgSO4#7H2O0.2g,K2HPO40.2g,氯化钠1.25g,NaHCO31.0g,水1000mL,pH=7.0。在28e,4000Lux条件下培养7d后测定OD660值。表1培养基正交试验因子水平表水平A酵母膏/(g#L-1)B乙酸钠/(g#L-1)C氯化铵/(g#L-1)D蛋白胨/(g#L-1)E微量元素/(mL#L-1)10.52.01.01.50.021.03.02.02.01.031.54.03.02.52.042.05.04.03.03.02结果2.1光合细菌菌株的筛选经过10~14d的培养,在培养基中出现圆形的铁饼状和点状菌株。挑取棕色铁饼状菌株9例,保存命名编号为PSB-B1~PSB-B9,最终选择生长最快的PSB-B4作为出发菌株。2.2菌体形态和培养特征图1PSB-B4菌体活细胞吸收光谱菌株PSB-B4革兰氏阴性,单个细胞为卵圆形和杆形,二分分裂繁殖,极生鞭毛,有时排列成规则链状,适中性环境下生长。在光照厌氧、黑暗好氧及微好氧条件均能生长,光照厌氧液体培养物由最初的浅黄色变为棕红色,瓶底和瓶壁出现少量的棕红色沉淀物,在半固体琼脂中形成0.5~1.5mm的铁饼状菌落。2.3分离菌细胞的吸收光谱试验结果显示(图1)PSB-B4菌株在375,400,430,475,535,615,825,880处有特征吸收峰,这表明PSB-B4菌株均含有菌叶绿素a和类胡萝卜素。具有紫色非硫细菌的吸收光谱特征。2.4生理生化试验结果生理生化试验结果如表2所示。表2分离菌株的生理生化试验项目结果项目结果项目结果接触酶+苯甲酸)氯化铵+乙酸钠+酒石酸钾钠(+)硫酸铵+柠檬酸钠+甘油+蛋白胨++酵母膏++乙醇+硝酸钠(+)硫代硫酸钠-甘露醇)硝酸钾(+)注:对于生理生化特征,/+0=阳性,/-0=阴性;对于碳氮源利用,/++0=生长旺盛,/+0=生长,/(+)0=微弱生长,/-0=不生长或几乎不生长。2.5菌种的初步鉴定综合以上的实验结果,根据5常见细菌系统鉴定手册6和5伯杰氏细菌鉴定手册6第八版中对光合细91第1期陶思源等:光合细菌PSB-B4的分离与培养条件优化研究菌各种属的检索步骤及特征描述,初步确定PSB-B4为紫色非硫细菌中红细胞属中的类球红细菌。2.6不同pH值条件对分离菌生长的影响从图2中可以看出,PSB-B4在pH=6.0,7.0,8.0条件下能够很好生长,最佳生长pH=7.0,在pH值为5.0或9.0时,生长明显减弱,表明其适应在中性环境下生长好。2.7不同光照强度影响分离菌生长的试验结果由图3可见,在温度28e条件下,PSB-B4在光照强度1000~5000Lux时,光合细菌的光吸收值随着光照强度的增加而增加,生长较旺盛。不过,在实验培养过程中发现在4000~5000Lux光照条件下PSB-B4均表现出生长迅速,菌液颜色迅速发生变化,但细胞老化较也较快,培养5~6d后,均出现细胞附壁现象,所以在光照强度3000~4000Lux下培养较为适宜。2.8正交试验结果从表3中的极差R值可以看出,5个因素影响光合细菌PSB-B4生长OD值得主次顺序为:ABCDE,因素A酵母膏PSB-B4生长的影响最大,因素E微量元素对其生长的影响最小,而且随着E水平的加大,细菌浓度呈递减趋势,在一定程度上反而起抑制作用。列表4-4中乙酸钠、氯化铵、蛋白胨、微量元素4因素的R值比较接近,比酵母膏的R值小许多,认为是次要因素。根据表3中各因素的均差大小,选择最佳培养基配方组合为:A4B3C2D4E1,综合以上结果,确定菌株PSB-B4的最佳培养基配方及培养条件为:酵母膏2.0g,乙酸钠4.0g,氯化铵2.0g,蛋白胨3.0g,磷酸氢二钾0.2g,硫酸镁0.2g,氯化钠1.25g,碳酸氢钠1.0g,蒸馏水1000mL,PH=7.0,培养温度28e,光照强度4000Lux。表3PSB-B4正交试验结果处理号酵母膏乙酸钠氯化铵蛋白胨微量元素OD660值11(0.05%)1(0.2%)1(0.1%)1(0.15%)1(无)0.71021(0.05%)2(0.3%)2(0.2%)2(0.20%)2(0.1%)0.70231(0.05%)3(0.4%)3(0.3%)3(0.25%)3(0.2%)0.77741(0.05%)4(0.5%)4(0.4%)4(0.30%)4(0.3%)0.81452(0.10%)1(0.2%)2(0.2%)3(0.25%)4(0.3%)0.85962(0.10%)2(0.3%)1(0.1%)4(0.30%)3(0.2%)0.82872(0.10%)3(0.4%)4(0.4%)1(0.15%)2(0.1%)0.88782(0.10%)4(0.5%)3(0.3%)2(0.20%)1(无)0.80893(0.15%)1(0.2%)3(0.3%)4(0.30%)2(0.1%)0.871103(0.15%)2(0.3%)4(0.4%)3(0.25%)1(无)0.922113(0.15%)3(0.4%)1(0.1%)2(0.20%)4(0.3%)0.839123(0.15%)4(0.5%)2(0.2%)1(0.15%)3(0.2%)0.929134(0.20%)1(0.2%)4(0.4%)2(0.20%)3(0.2%)1.051144(0.20%)2(0.3%)3(0.3%)1(0.15%)4(0.3%)0.864154(0.20%)3(0.4%)2(0.2%)4(0.30%)1(无)1.196164(0.20%)4(0.5%)1(0.1%)3(0.25%)2(0.1%)1.120K13.0033.4913.4973.3903.636K23.3823.3163.6863.4003.580K33.5613.6993.3203.6783.585K44.2313.6713.6743.7093.376k10.7510.8730.8740.8480.909k20.8460.8290.9220.8500.895k30.8900.9250.8300.9200.896k41.0580.9180.9190.9270.844R0.3070.0960.0920.0790.06592沈阳师范大学学报(自然科学版)第28卷3讨论光合细菌能够在水圈多个生态系中生活,表现出很强的适应能力,这与光合细菌多元化代谢能力是分不开的,不同生态环境中的光合细菌对营养物质的利用能力有很大的差异。本文以从有机污水中分离得到一株生长较快的光合细菌菌株为研究对象,对其的生理特性进行测定分析,并最终确定该菌株的最适培养条件。酵母膏对光合细菌PSB-B4的生长有显著的促进作用,用量增加,则生长速度加快,但在本试验水平的范围内对优化目标的影响趋势没有极大值,这说明原先选择的试验水平范围偏低,在考虑到为防止其他微生物污染的情况下,设计时就采用了2.0g/L的用量。微量元素在少量范围内对光合细菌的生长有一定的作用,但作用很小,随着浓度的提高,反而起到抑制作用,因此最后在培养基中最后去掉了微量元素这一项。随着光合细菌在诸多领域的应用,对光合细菌制剂的需求量在不断增加,选择合适的培养基质,可以缩短光合细菌培养的时间,提高其活性,为建立该菌株的生产工艺以及菌剂的生产奠定基础。参考文献:[1]韩梅,陈锡时,张良,等.光合细菌研究概况及其应用进展[J].沈阳农业大学学报,2002,33(5):387-389.[2]高卫东,张士玮.光合细菌的生态意义及应用初探[J].兰州教育学院学报,2005(1):61-64.[3]揭晶,赵越.光合细菌应用的研究进展[J].广东药学院学报,2006,22(1):113-115.[4]潘晶,张金松,孙铁珩.苏云金杆菌以色列变种防治水处理中摇蚊幼虫研究[J].沈阳师范大学学报:自然科学版,2007,25(1):80-82.[5]赵斌,何绍江.微生物学实验[M].北京:科学出版社,2004:257.[6]操玉涛.光合细菌M-01的培养条件优化研究[J].生物学杂志,2006,23(1):26-28.[7]孙军德,赵春燕,李炳学,等.光合细菌双层平板计数方法的研究[J].沈阳农业大学学报,2001,32(2):110-112.[8]刘军义,江文龙,李娟.光合细菌菌落计数培养基的研究[J].微生物学杂志,2005,25(2):18-22.[9]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:9-42.[10]R.E.布坎南.伯杰细菌鉴定手册[M].北京:科学出版社,1984:16-29.[11]崔战利.沼泽红假单胞菌X1菌株的分离鉴定与培养基优化[J].黑龙江八一农垦大学学报,2004,16(3):11-14.[12]邓晓皋,唐.几株光合细