广西大学高级生物化学课件重组DNA技术2

重组DNA技术姜伯乐第一节概述DNA克隆(DNAcloning)：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆（genecloning）。基因工程（geneticengineering）：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技术（recombinantDNAtechnology）一、克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等1、目的基因（targetgene）：cDNA或基因组DNA2、载体(vector)：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等cDNA（complementaryDNA）：指体外经反转录合成的，与RNA（常指mRNA）互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。基因组DNA（genomicDNA）：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组DNA。质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。3.1限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease):存在于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。3、工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、DNA酶，等常用的是II类限制性内切酶许多限制性核酸内切酶II的识别序列属于回文结构配伍末端（compatibleend）：不同限制性内切酶产生的相同粘性末端3.2DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）、Klenow片段(Klenow酶)、T4DNA聚合酶以及Taq酶等3.3DNA连接酶T4连接酶：可用于粘端与平端的连接4、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞☺DH5α,JM109(RecA1,endA1,gyrA96,thi,supE44,relA1,△(lac-proAB)/F’[traD36,lacIq,lacZ△M15])☺M15☺INVSc1(MATahis3Δ1leu2trp1-289ura3-52/MATαhis3Δ1leu2trp1-289ura3-52),Phenotype:His-,Leu-,Trp-,Ura-第二节DNA克隆的基本过程分、切、接、转、筛、表达一、“分”：目的基因及载体的制备1、分离基因的方法：化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）：在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特异引物及耐热的DNA聚合酶（常用Taq酶），经多次变性、退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指数合成的过程cDNA文库(cDNAlibrary)：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)：利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，总称基因组DNA文库2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA克隆载体（cloningvector）：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等pUC19,pK18mob…表达载体(expressionvector)：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物pQE30,pYES2…二、“切”：限制性内切酶切割目的基因和载体DNA三、“接”：重组体的构建四、“转”：重组DNA分子导入受体细胞1、转化（transformation）：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程2、转染（transfection）：将外源DNA导入真核细胞的过程3、感染（transfection）：以l噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。也称为转导（transduction）五、“筛”：筛选出含重组DNA的受体细胞1、直接选择法：遗传标记【抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂交）】2、非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法六、“表达”：使克隆基因在宿主细胞中复制、表达1、外源基因在原核细胞的表达大肠杆菌是最常用的原核表达体系真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体2、真核表达体系：酵母、昆虫及哺乳动物细胞等突变方法插入突变（转座子）整合突变（自杀质粒）缺失突变点突变定点突变随机突变：插入突变细菌转座子：插入序列（Insertionsequences）复合转座子（Compositetransposons）TnA转座子家族（TnAfamlily）可转移噬菌体（Muphage）Tn5gusA5EZ-Tn5DistributionofTn5gusA5inthegenome（partial）ConfirmationofTAIL-PCRdeterminedtransposonpositionbyPCRORF2ORF2gusAIS50RKanORF1ORF3PredictedsizeofPCRproductUPDPIS50RSPM123456789101112131415161718192021222324gusASPPredictedsizeofPCRproductM:DNAmarker(100bp)；1~24:PCRproductsStrategyofpK18mobintegrationmutagenesisPhysicalmapofpK18mobNonpolargeneinactivationbysinglesiteintegrationofahomologousplasmidPlacKanlacZTargetORFpK18mobchromosomePlacKanlacZPartialseqofORFchromosomemutantPlacKanlacZDownstreamORFSPPCRGelanalysisMutantcomfirmationPfuAmplificationoftruncatedfragmentsoftargetORFDigestionofpK18mobwithSmaIT4DNALigaseElectro-transformationScreeningandconfirmationTri-parentsconjugationScreeningandconfirmationMutantspreservationATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT平连ATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC3n(3n+2)酶连ATGATTACGAATTC3n+1(3n+2)引物设计注意事项5’端整合突变体验证StrategyofpK18mobSacBdeletionmutagenesissacBgeneBacillussubtilis(枯草杆菌)sacBgenethatencodeslevansucrase(蔗糖-6-果糖基转移酶)isaparticularlyusefultoolsinceitprovidesapositiveselectionfortherecombinationevent.Encodinglevansucrase(Lepesantetal.,1974),itsexpressionisinhibitorytothegrowthofmanyGram-negativeandgram-positivebacteriainthepresenceofsucrose(Gayetal.,1985;RiedandCollmer,1987;Kanigaetal.,1991;Jageretal.,1995;Pelicicetal.,1996)ABCDpK18mobSacB整合1st整合2nd整合pT18mobGmLeftflankRightflank8004genomeAmplifiedfrompPH1JIKpnIBamHIXbaIEcoRI缺失突变技术路线TargetORF缺失突变技术路线1、取旁侧序列(1.5kb）2、设计旁侧引物和Gm引物(EcoRI,KpnI,BamHI,XbaI,PstI,HindIII)3、扩增旁侧和Gm片段4、酶切载体、旁侧和Gm片段5、四片段连接，转化，Tc,Gm,IPTG,X-Gal筛选6、以两外侧引物扩增验证和酶切验证7、阳性克隆三亲导入Xcc8004，Rif,Gm筛选8、筛选Tc敏感接合子9、PCR验证（8004、Tcr、Tcs）概述1973，Cohen等人首次使用DNA克隆技术成功一、克隆与克隆化克隆即指同一副本或拷贝（copy）的集合；获取同一拷贝的过程叫克隆化。【实例】肝组织分离肝实质细胞单一肝实质细胞繁殖----------细胞克隆自众多分子中分离获得相同分子，即为分子克隆，在分子生物学和遗传学领域所谈的分子克隆专指DNA克隆.一、质粒的特点：1、环状DNA，2kb～数百kb。2、某些质粒可以重组到染色体中复制，形成附加体。质粒载体3、质粒的遗传信息可以赋予细胞某些性状（抗药性等），这些形状的有无常用于鉴定质粒是否存在于活细胞中。4、质粒复制分两型——严谨型、松弛型松弛控制性质粒，拷贝数多，不受细胞内染色体控制。5、质粒含易位子和易位现象。易位子是质粒上的特定DNA序列，它可以从所在质粒易位于其它质粒或染色体中，它对细菌的进化有意义。质粒载体严谨控制型质粒，拷贝数少，复制受染色体控制。质粒载体理想载体的条件：1、具有自主复制能力；2、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开；3、分子量相对较小，能够容纳目的基因；4、具有较多单一限制性内切酶位点；5、有一个或多个筛选标记；6、具有较高的遗传稳定性。TheconstructedplasmidpBR322质粒载体外源基因插入位点EcoRⅠ含一个复制起始点（ori）抗药基因terr和ampr1977年由Boliver等人自E.coli的天然质粒建成。1、克隆载体常用克隆载体AnexampleofanE.coliexpressionvector质粒载体2、表达载体外源基因插入位点复制起始点（ori）标记基因启动子调控序列核蛋白体结合序列常用表达载体E.coliYeast噬菌体载体常用噬菌体：l噬菌体载体、M13噬菌体1、l噬菌体载体（1）结构：线性双链DNA，由三个片段组成（左臂、中央、右臂）；感染细菌后，可以形成封闭环分子。（2）两类载体置换型载体：适于基因组DNA克隆。插入型载体：适于cDNA克隆。其它类型载体一、柯斯质粒（cosmid）二、逆转录病毒载体三、Ti质粒可重组45kb的大片段适用于动物细胞的基因工程用于植物细胞基因工程=6305pLAFR20352bpEcoRI(1)SalI(16146)SmaI(15018)SmaI(15784)SphI(1232)SphI(4356)SphI(10825)SphI(17478)pLAFR1,pLAFR3,pLAFRJ,pLAFR6SacIKpnIDNASeq.2004Jun;15(3):225-7.GeneticandphysicalmapofthepLAFR1vector.VanbleuE,MarchalK,VanderleydenJ.CentreofMicrobialandPlantGenetics,Kath