海洋沉积物中反硝化细菌的分离及去除硝酸盐氮模拟试验全为民

生态环境与可持续发展.分论坛海洋沉积物中反硝化细菌的分离及去除硝酸盐氮模拟试验全为民’,沈新强’,甘居利’,沈晓盛’(1.农业部海洋与河口渔业重点开放实验室,中国水产科学研究院东海水产研究所,上海200090;2.农业部渔业生态环境重点开放实验室,中国水产科学研究院南海水产研究所,广州510300)摘要:本研究从长江口沉积物中筛选分离出了海洋反硝化细菌,模拟了该细菌对不同浓度水平硝酸盐氮的去除效率。研究结果表明,分离出的海洋反硝化细菌能有效去除海水中硝酸盐氮,在硝酸盐氮初始浓度为lgmL/,d1内硝酸盐氮去除率就达到了7%0;在100mgL/硝酸盐氮模拟试验中,约在一周内能将9%0硝酸盐氮去除。试验证实反硝化细菌的生长与水体中硝酸盐氮浓度有一定的相关关系,一旦生物修复过程完成,反硝化细菌就会大量死亡,水体重新恢复到清澈透明状况。关键词:反硝化细菌;生物修复;硝酸盐氮;去除IsolationofDenitrifyingBaeteriainSeaSedimentnAdSimulatedExperimentofRe助vingNitrateFromSea份aterQ以Nwei一min`,SHENxian一qiang,,eANJu一11’,sHENxiao一sheng,(1.KeyandopenLaboratoryofMarineandEstuarineFisheries,MinistryofAgrieulture,EastChinaSeaFisheriesResearehInstitute,ChineseAeademyofFisheriesSeienees,Shanghai200090,China:2.KeyandOPenLaboratoryofFisheriesEeologiealEnvironment,MinistryofAgrieulture,SouthChinaSeaFisheriesResearehInstitute,ChineseAeademyofFisheriesSeienees,Guangzhou510300)Abstraet:Thegoalofthisreseareh15toisolatedenitrifyingbaeteriafromseasedimentand5imulatetheremovaleffieieneyofnitrate一Nfromseawater.Theresultshowsthiskindofbaeteriaeaneffeetivelyremovenitrate一Nfromse四ater.Theremovaleffieieneyreaehesabout70%withinonedaywhentheinitialeoneentrationofnitrate一N151mg/L.About90%ofnitrate一N15re旧ovedbydenitrifyingbaeteriafromse翻aterinaweekwhentheinitialeoneentrationofnitrate一N15100mg/L.It15foundthatthere15eorrelationbetweentheeoneentrationofnumberofdenitrifyingbaeteriainthewater.Lotsofba吹eriawilldeadandtheeomPleted.nitrate一NandthewaterwillbeeometransParentKeywords:oneeasthebioremediation15Denitrifyingbaeteria;Bioremediation;Nitrate一N;Removal8浙江省科学技术协会首届长三角科技论坛月lJ舀近几十年来,伴随沿海地区经济的迅速发展、城市化进程的加快与沿海养殖业的快速发展,近岸海域环境质量逐年下降、污染范围不断扩大,对海洋环境、海洋资源和海洋经济发展以至于人们的健康造成了严重的影响,己引起国际社会的广泛关注川。自从20世纪80年代末至90年代初美国环境保护局在阿拉斯加石油泄露导致海滩严重污染的生物修复项目取得成功以后,生物修复技术的迅速发展和广泛应用为人类解决海洋污染提供了新的方法和希望。目前,海洋污染的生物修复主要集中在以下领域:多环芳烃污染、石油污染、农药污染、有机污染、赤潮灾害等,而关于近岸海域氮磷污染的修复技术研究仍然比较少见:,幻’,二’。近年来的监测结果表明,长江口近岸海域氮磷含量十分丰富,其中以无机氮污染最为严重,大约90%的无机氮是以硝酸盐形式存在,近岸海域已呈现严重富营养化水平`6;,因而近岸海域无机氮污染的生物修复技术应成为当前海洋污染治理的重点研究领域之一。众所周知,在氮的生物地球化学循环过程中,微生物起着关键的作用,如由微生物引起的硝化一反硝化作用是土壤、湿地中氮素释放的重要机制之一,有学者基于此原理,提出了利用固定化氮循环细菌技术来净化富营养化水体,促进氮释放,在许多淡水水体中进行了小范围试验,取得较好的治理效果川、8’。而关于海水无机氮污染的生物修复研究至今未见报道,本研究试图探索出海洋反硝化细菌的筛选和分离方法,然后利用该生物修复菌进行去除海水硝酸盐氮的动态模拟试验,从而为长江口近岸海域无机氮污染的生物修复提供技术上的保证。2材料与方法2.1反硝化细菌的筛选与分离2004年5月份从民江口取得海洋沉积物样品一份,返回实验室后,各取抢左右的沉积物泥样置于2套反硝化装置三角瓶中,另1套反硝化装置作为对照,然后分别向3个三角瓶中倒入反硝化细菌培养基至瓶颈,自发酵管上端滴入2ml20%KOH溶液,用以吸收培养过程中产生的CO:,迅速塞紧二角瓶上的胶塞,最后将培养瓶置于30℃恒温培养箱中培养。待培养7天后,取lfnl培养液接种于新鲜反硝化细菌培养基中,经3次重复后的培养液为试验反硝化细菌{闷}。反硝化细菌培养基配制方法:2.09KN。:、0.039Mgs叭·7H刃、0.sg:KI护O;、2饭酒石酸钾钠、59NaCI、I000ml蒸馏水。浙江省科学技术协会生态环境与可持续发展.分论坛2.2生物修复模拟试验模拟试验I取413lm陈海水(盐度350%,硝酸盐氮浓度低于。.10ogm/)L,用蒸馏水稀释至10O0ml,使其盐度达到5%。;称取0.72189KN03溶解于其中,使硝酸盐氮浓度约为100mgL/。然后将I000ml溶液分装于4个25Oml三角瓶中,其中1个作对照,不加反硝化细菌培养液,向另3个三角瓶中各加入5耐反硝化细菌培养液,放置于室温下,定时取样测定水体中硝酸盐氮的浓度和反硝化细菌的生长情况。模拟试验H具体设计方法与试验I基本相同,而硝酸盐氮初始浓度为1mg/oL测定方法硝酸盐氮用锌一锅还原法测定,反硝化细菌以检测波长68Omn的吸光值(人680)来表示其生长情况〔、10],用蒸馏水作测定对照。3结果在模拟试验I中,硝酸盐氮的初始浓度为100mgL/,第d7三个处理(处理1、2和3)硝酸盐氮的去除率就分别达到了8%9、87%和95%,其中处理3第d4硝酸盐氮去除率就达到了92%,比前两个处理提前了d3。在整个试验期间,3个处理三角瓶内试验液上方总伴随有大量气泡(N2)产生,而对照瓶内没有出现气泡,且硝酸盐氮浓度基本保持在100mg几左右,可见此次分离出的反硝化细菌具有较强的活性,能有效去除水体硝酸盐氮(图1)。除对照水体一直保持清澈透明外,3个处理中反硝化细菌的前期生长模式近似于Logistic“S”型曲线,但后期由于硝酸盐氮浓度下降,导致反硝化细菌生长受到水体硝酸盐氮含量的限制,从第d7开始反硝化细菌的数量呈现逐步下降趋势,但硝酸盐氮去除率仍然持续上升,第1d0硝酸盐氮去除率达到95%,整个试验完成时(1d3)硝酸盐氮去除率约为98%。浙江省科学技术协会首届长三角科技论坛又寸照处一lnn曰凸凸ǎh口尸夕工ù12-~今~~-闷卜--,山-..目.~~0二一时卜处一2处一3门ǎ,ù\毖-工rà圳窿一草勺。qóo的qoǎ0的9代à习报彭026天数(由81012天数(d)DaysDays图1模拟试验工中反硝化细菌的生长情况及硝酸盐氮去除效果(肋生长情况(B)硝酸盐氮去除F19.1Growthofdenitrifyingbaeteriaandremovazofnitrate一Ninfirstsimulatedexperiment(initialConCentrationofnitrate一N:100mg/L)(A)growth模拟试验11的结果表明(图2),ld内硝酸盐氮的去除率就达到了70%,到第d6硝酸盐氮去除率稳步上升到5S%,而后水体硝酸盐氮浓度保持稳定:而对照硝酸盐氮浓度基本保持在1mg几左右。在整个试验期间,对照水体一直保持清澈透明的状态,而3个处理反硝化细菌的生长模式呈典型的峰型曲线,第d3到达其生长高峰,而后迅速下降,第6d处理组和对照组水体均呈现出清澈透明状况,表明d6后反硝化细菌基本死亡,因而水体硝酸盐氮浓度不再继续降低。0.10nù匀ù,二12八匕.工Q]ó日门八Uǎ日八éǎ、一\切ùxl)绍窿军0.02只éó日.0。一1ē允ō卜nU曰住吧嗽一J洲。叻ē一0ǎO犯旧Yà注长督0.00天数(d)Davs4大数(d)图2模拟试验H中反硝化细菌的生长情况及硝酸盐氮去除效果(A)生长情况F19.2Growthofdenitrifyingbaeterlaandremovalofnitratein6810DaVS()B石肖酸盐氮去除seeondslm日latedexperiment(inl屯laleoneentrationofnltrate一N:1mg/L)(A)growth(B)工·emovalof通过比较模拟试验I和H的研究结果,可以发现反硝化细菌的生长繁殖速度、硝酸盐氮的最终去除率和最终浓度均与初始硝酸盐氮浓度成正比,即初始浓度越高,反硝化细菌的生浙江省科学技术协会生态环境与可持续发展.分论坛长繁殖速度越快,生长量越多,硝酸盐氮的最终去除率和最终浓度越高,如试验I最终去除率为98%,试验n最终去除率为8%5。4讨论应用反硝化细菌处理水体中的硝酸盐氮是一项新兴技术,也是目前国内外研究的热点。菌种的筛选分离是生物修复的第一步,大多数研究都是从污水处理厂和对虾养殖场的底泥中筛选细菌,而本研究是直接从海洋沉积物筛选分离该类细菌,证明海洋反硝化细菌经富集培养后能有效去除水体硝酸盐氮,且硝酸盐氮去除率与许多研究的结果基本相当;但在反硝化速率方面有一点差异,如谭佑铭等人!川从污水处理厂分离出的反硝化细菌经固定化后,能在6h内去除90%石肖酸盐氮,这可能与反硝化细菌的分离地点、实验条件、富集培养技术和固定化技术等诸多因素有关;本研究的模拟试验结果与李正魁等人的研究结论还是比较相似的,均在d7左右去除约90%硝酸盐氮{”。生物修复作用的成功与否很大程度上与降解微生物群落在环境中的数量及生长繁殖速率有关,通常菌株的生存受到许多因素的影响,例如:PH、温度、氧化还原能力、溶解氧、水分的供给等非生物因素及微生物之间的竞争、捕食等生物因素,固定化后的微生物可一定程度上提高其对PH值、有机物浓度和生物毒性等环境因素变化的适应,如有研究发现,水样PH值对固定化细胞的反硝化作用影响不太大,温度变化对硝酸盐氮的去除率有一定的影响,但在低温条件下亦有较高的反硝化率,证明反硝化细菌经固定后对低温有较强的耐受能力t.76·”’。目前用于反硝化细菌的固定化载体主要有聚乙烯醇、活性炭和低温辐射制备的高分子载体等,而本研究并未使用最新的固定化微生物技术,在试验中是通过直接添加反硝化细菌的方法来进行生物修复的模拟试验,主要考虑到本项技术是着眼于解决大面积的近岸海域无机氮污染问题,减少固定化载体使用所带来的生态风险问题。另外,本研究模拟试验所使用的水是由外海的陈海水(水质较好)与蒸馏水配制而成的,水体清澈透明、盐度恒定,整个试验期间水体呈静止状况,与长江口近岸海域的混浊水体和复杂的水文条件(盐度时空差异较大、混合过程剧烈)相比有很大的