海洋光合细菌生产性培养技术研究

海洋光合细菌生产性培养技术研究摘要本文通过对海洋光合细菌的培养液制备、培养生态条件、接种浓度和培养周期的研究,采用人工海水培养液克服了海洋光合细菌一级培养液沉淀问题,设计的尼龙大拥三级培养工艺成本低廉易推广应用于群众性生产。关艘词海洋光合细菌培养生态光合细菌是一类能在厌氧光照条件或好氧黑暗条件下利用有机物作供氢体兼碳源进行不放氧光合作用的细菌,由于其独特的生理生化特性,近年来已推广应用于水产养殖并取得显著效果。[lj图圈川为了使其能在水产养殖中得到更为广泛的应用而提供大量廉价菌液,我们于1995一1996年对海洋光合细菌培养技术、生产工艺进行了试验研究,并为养殖生产提供了12t高质菌液,现将试验情况总结如下:1材料与方法1.11.1.1材料菌种来自青岛海洋大学,经分离、纯化、筛选、重新组合成的复合菌株。1.1.2基础培养基成份氯化氨0.1%,碳酸氢钠0.1%,醋酸钠0.3%,磷酸二氢钾0.03%,硫酸镁0.01%,酵母膏0.05%,微量元素母液0.1%。1.21.2。1试验内容与方法培养液制备试验一级培养液容器为500ml盐水瓶,试验培养液分别为1#(基础成份加自然海水)、2“(基础成份加人工海水)、3#(基础成份配自然海水灭菌后加磷酸盐)三种。经高压灭菌后,观察培养液沉淀状况,并在无菌条件下等量接种,观察细菌生长状况,以60拜m波长,0.scm比色皿测定消光值(下同)。二级培养液容器5000一10000ml玻璃瓶,试验培养液为1”液和2”液二种,经煮沸消毒,于无菌室内等量接种培养,观察细菌生长状况。收稿日期:1997一12一101期朱励华等:海洋光合细菌生产性培养技术研究三级培养液容器为501塑料圆桶,试验培养液为1“液和2“液二种,用次氯酸钠消毒,硫代硫酸钠还原,按三级培养方法,二组等量接种培养,观察细菌生长情况。L2.2培养生态条件试验在一级培养中,用不同温度、光源、光照强度和pH值等生态因子进行光合细‘菌生长影响试验;用自制控温培养箱调节温度,用不同功率的灯泡调节光照强度,用碳酸氢钠或氢氧化钠调节pH值。每天定时测定菌液消光值、pH值,注意附壁、沉淀等现象,记录细菌生长情况。充气试验,容器为1000oml的玻璃瓶,采用二级培养方法接种后,分为四组:A组24h连续光照不充气;其余三组均为自然光照下进行。B组不充气,C组充气,D组半充气(仅晚间黑暗充气)。观察菌液色泽、气味、瓶底沉淀物等现象,并记录细菌生长状况。L2.3接种浓度和培养周期试验sooml盐水瓶作容器,分别按不同比例l比5(E)、l比4(F)、l比3(G)、l比2(H)、1比1(D进行接种,采用一级培养方法,每天定时测定菌液消光值和pH值,记录细菌生长情况。并对结果进行处理,比较K值大小。K=(Dn一D。)/T式中:K—:生长效率D。—:n天后的消光值D。—:初始消光值1.2‘4T—:培养时间(d)三级培养试验用501塑料圆桶作容器,分室内控温25一28‘C、光照1000一2000烛光(J)和室外大棚自然条件培养(K)二组,每天定时测定菌液消光值和pH值,观察细菌生长状况。2结果2.1培养液制备试验表1培养液的不同制备方法对海洋光合细菌的影响Table1TheeffertofthedifferentmanufaeturemethodofeultivationliquidonmarinePhotosynthetiebaeteria消毒灭菌法培养液培养液的沉淀状况起始消光值培养sd后消光值++0.4770.845一级培养2#高压灭菌3#二级培养煮沸消毒三级培养次抓酸钠消毒0.3850.385十1.2001.2050。4700.3850.3840.3840.96212011.1901.195####‘.上夕曰.二勺白浙江水产学院学报17卷经5d培养结果见表1,从表1可见,三组培养液均能不同程度地促使细菌生长,在一、二级培养中,1“液产生沉淀,细菌消光值增长为0.368和0.482,其增长值与沉淀程度成反比。2“液和3“液无沉淀现象,细菌消光值增长为0.806和0.811。2.2培养生态条件试验2.2,1温度试验从表2可见,光合细菌在10一42‘C的温度下活动正常;在25一28℃的温度下生长最适,并能保持较长时间的活力;30‘C以上亦能生长,但易老化下沉;5℃以下细菌下沉,活力差,复活困难。2.22光照试验从表2可见,在500一2000烛光范围内,光照度越强,效果越好,室内采用25一60瓦白炽灯作光源可满足生长,注意培养物需离灯泡30cm以上,否则易产生附壁现象。表2温度、光照对海洋光合细菌生长繁殖的影响Table2TheeffeetoftemPeratureandlightonthegrowthandreProduetionofmarinePhotosynthetiebueteria试验条件5℃10℃25一28℃30一35℃40一42℃500烛光1000烛光2000烛光起始消光值5d后消光值10d后消光值备注0.3840.3840.3850.3850.3850.3840.3840.3840.3840.3851.0951.1051.1100.8991.0901.0980.3840.3841.3801.2511.007活动少,下沉活动正常活泼活泼,少量结块活泼,结块多注:温度试验的光照强度为1000烛光,光照强度试验的温度为26℃士l℃。2.2.3pH试验从表3可见,细菌在pH6.5一7.5范围内均能生长,当pH值超过8.5时,细菌生长受到抑制。表3培养液不同pH值对光合细菌的影响Table3TheeffeetofthedifferentPH一valueofeultivation1iquidonPhotosynthetiebaeteria培养液pH值7d后pH值生长情况8.5正常8.5正常0.0下沉充气条件试验经4d培养,结果见表4,不充气培养效果好于充气培养;连续光照培养效果优于自然光照培养。A组细菌消光值最大为0.970,B组次之,消光值为0.800,C和D组较差,消光值为0.51和0.48。2.3接种浓度和培养周期见图1,不同接种浓度对光合细菌生长有显著影响,通过K值比较H组(接种浓度0.4771期朱励华等:海洋光合细菌生产性培养技术研究表4光照及充气对光合细菌生长繁殖的影响Table4TheeffeetoflightandaerationonthegrowthandreProduetionofPhotosynthetiebaeteria光照时间充气条件不充气不充气充气间隔充气组别起始消光值4d后消光值菌液颜色24h连续光照0.3850.970BC0.3830.3840。3840。8000。5100.480红色,菌膜少红色,菌膜少混浊,菌膜多混浊,菌膜多自然光照消光值)为最大,达0.161;依次为G组、I组、F组,K值分别为0.146、0.144、0.134;最小是E组(接种浓度0.250消光值),仅0.125。对H曲线的K值进行连续比较,可分为三段。从接种至培养第四天,为快速生长期(指数生长期),K值0.161;第四天至第九天为相对生长下降期,K值0.052;第九天开始为静止期,K值接近O。细菌浓度10培养时间(d)图1光合细菌不同接种浓度下的生长曲线Fig.1Thegrowtheurveofphotosynthetiebaeteriaatdifferentinoeulationeoneertration2.4三级培养对比试验由图2可见,大棚组(J)生长速度快于室内组(K),经10d培养,大橱组消光值达到1.20而室内组仅0.810。浙江水产学院学报l7卷浓;哭-098765IL住以住以压:.:10培养时间(d)图2光合细菌三级培养对比生长曲线Fig.2TheeontrastgrowtheurveofPhotosynthetiebaeteriainthird一stageeultivating3讨论3.1关于海洋光合细菌培养液的制备在一、二级培养中,由于海水加人基础培养成份经高压灭菌或煮沸消毒产生沉淀,影响细菌生长,如采取分步配制方法,即先将部分基础营养成份和海水灭菌后加磷酸盐,这样避免了沉淀现象,但操作较繁琐,易污染。采用人工海水加基础成份配制的培养液,可一步到位灭菌,操作简便,而且细菌生长正常,解决了海洋光合细菌一级培养液沉淀的问题。在三级培养中,采用次氯酸钠消毒法,不存在因加热、煮沸消毒或高压灭菌引起的沉淀问题。用人工海水或自然海水加基础成份配制的培养液,均使细菌正常生长,而且二者无明显差异。所以,在海水提取方便处可使用自然海水,若远离大海,则用人工海水能达到同样的效果。3.2有关生态条件的确定据有关资料介绍圈[6j,光合细菌适温为10一35℃。而据我们自己试验,光合细菌能耐较高温度,在40一42C下镜检,细菌仍活泼、生长繁殖正常,这为夏季室外培养提供了可行性依据。充气条件试验结果和陈世阳等[5j对红单胞菌最佳条件的试验结果(光照不充气)是一致的,充气在光合细菌的培养上有二方面的作用:第一、在利用光合细菌处理有机废水的过程中,充气能促进好氧菌对高分子有机物的降解,降解后的低分子有机物易被光合细菌利用;第二、充气提供了光合细菌在好氧黑暗情况下进行化能异养代谢的条件。我们目前的培养条件1期朱励华等:海洋光合细菌生产性培养技术研究下,如果充人气体没有经过净化处理,反而增加了杂菌污染,如有条件,采用密封搅拌使其受光均匀,促进生长。在我们的试验中虽然A组为最佳条件,其结果好于B组,但晚间光照需要耗电,在简易大棚培养中,又会招引许多飞蛾小虫,所以,在生产性培养中,为降低成本,建议采用自然光照,不充气条件培养为宜。3.3产品浓度的确定根据图1及H曲线的K值连续比较,相对生长下降初期对应的消光值为1.12一1.20,细菌浓度达到此值以后,生长速度减慢,K值从0.161降至0.065,并不断有细菌产生沉淀。所以,为保证菌液的密度和细菌活力,充分利用培养液营养成份,在生产培养中,光合细菌产品的标准以消光值达到1.20(经计数,密度达10亿/ml细菌以上)为宜。3.4接种浓度和培养周期根据不同接种浓度的试验,接种比例愈高(起始消光值愈大)生长达到消光值1.20的时间愈短。因此在生产急需时,可以高比例接种,以便快速提供产品。但是,真正标志生长优劣对生产有积极意义的应该是K值。通过K值比较,接种浓度0.477组的K值最大,它减少了高浓度接种的工作量,同时,缩短了低浓度接种的延缓期。可以认为,在目前的培养条件下生产性接种浓度以消光值0.477左右较为合理。3.5三级培养试验尼龙大棚组优于室内组,是因为在6一9月份,自然气温达到细菌生长要求,尼龙大棚三级培养工艺能有效地利用光能、热能。而室内组采用电灯光源,在靠近灯泡处附壁严重,同时又因塑料桶透光性差,不能有效地利用室内的人工光能,抑制了细菌生长。所以,在夏季,采用室外尼龙薄膜大棚三级培养,节约成本,操作方便,易推广应用。至于在室内条件下如何采用透光性能好的培养容器,改善培养效果,有待进一步试验。4小结(1)采用人工海水加基础营养成份配制的培养液,解决了海洋光合细菌一级培养液沉淀的问题。(2)光合细菌适温范围10一42C,最适25一25‘C;适宜pH值6.5一7.5;在500一2000烛光范围内,光照强度越强,效果越好;光照不充气培养好于充气培养。(3)产品标准以消光值达1.20为宜。接种浓度以消光值0.477左右为佳。(4)夏季尼龙大棚三级培养工艺,成本低廉、操作方便,易推广应用。参考文献董慧智.光合细菌(PsB)饲喂海湾扇贝幼体的试验河北渔业.1990,(4)孙昭兴.光合细菌在对虾养殖中应用研究初报.齐鲁渔业,1988(2)乔振国.光合细菌在虾类育苗七的应用.饲料工业.工989(4)陈世阳.光合细菌的特征及其开发利用.海洋通报.1991,10(1):24一32王立超.温度、光照和pH相互关系及其对光合细菌生长的影响.齐鲁渔业,19一321997,14(5):43一45l2浙江水产学院学报17卷ASTUDYONTHE