海洋异养硝化好氧反硝化菌y6同步脱氮除碳特性

中国环境科学2017,37(2)：686~695ChinaEnvironmentalScience海洋异养硝化-好氧反硝化菌y6同步脱氮除碳特性王骁静,于德爽,李津*,都松东,周同,吴国栋(青岛大学环境科学与工程学院,山东青岛266071)摘要：从胶州湾海底沉积物中分离筛选出一株异养硝化-好氧反硝化菌株y6,通过菌株y6的形态以及生理生化特性和16SrRNA基因序列的分析,鉴定该菌株属于克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.).在不同的环境条件下,测定菌株y6的生长情况和脱氮能力,研究其同步脱氮除碳特性.实验结果表明,菌株y6的最佳碳源为柠檬酸三钠,最适宜pH值为7.0,最适合的C/N为17.菌株y6在以NH4Cl、KNO3和NaNO2为唯一氮源的反应系统中均有较好的脱氮效果,去除率分别为99.67%、100%、99.20%.菌株y6在脱氮的同时能高效地去除有机物,COD的去除率分别为82.17%、95.75%和97.83%.菌株y6在硝化过程中没有亚硝态氮和硝态氮的积累.在按不同比例混合氮源的反应系统内,首先进行的是硝态氮的好氧反硝化,随后进行的是氨氮、亚硝态氮和COD的去除.在有亚硝态氮存在时氨氮的去除率略低,亚硝态氮会影响y6的异养硝化过程,异养硝化对好氧反硝化过程没有影响.关键词：异养硝化-好氧反硝化；海洋菌株；克雷伯氏菌y6；同步脱氮除碳中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1000-6923(2017)02-0686-10SeparationidentificationandthecharacteristicsresearchofsimultaneousremovalofnitrogenandcarbonaboutMarineheterotrophicnitrificationandaerobicdenitrificationstrainy6.WANGXiao-jing,YUDe-shuang,LIJin*,DUSong-dong,ZHOUTong,WUGuo-dong(SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,QingdaoUniversity,Qingdao266071,China).ChinaEnvironmentalScience,2017,37(2)：686~695Abstract：Aheterotrophicnitrification-aerobicdenitrificationstrain,namedy6,wasisolatedfromsedimentofJiaozhouBay.ItwasidentifiedasKlebsiellasp.basedonthemorphological,physiologicalandanalysisof16SrRNAgenesequence.Underdifferentenvironmentalconditions,measuredstrainy6’sgrowthsituationanddenitrificationability,soastoanalyzeitscharacteristicsofsimultaneousremovalofnitrogenandcarbon.Theresultsshowedthattheoptimalcarbonsourcewassodiumcitrate;theoptimalpHwas7.0;theoptimalC/Nwas17.InthereactionsystemofNH4Cl,KNO3andNaNO2fortheonlynitrogensource,Strainy6hadbetterdenitrificationeffect.Theremovalefficiencieswere99.67%,100%and99.20%.Strainy6couldefficientlyremoveorganicmattersimultaneouslyintheprocessofdenitrification,withCODremovalrateof82.17%,95.75%and97.83%,respectively.Almostnonitratenitrogenandnitritenitrogenaccumulationinthey6heterotrophicnitrificationprocess.Inthedifferentmixingratioofreactionsystem,thefirstwereaerobicdenitrificationofnitratenitrogen,Subsequentwereammonianitrogen,nitritenitrogenandCODremoval.Ammonianitrogenremovalratewasonlyslightlylowerinthepresenceofthenitratenitrogen.Thenitritenitrogenaffectedy6heterotrophicnitrificationprocess.Theheterotrophicnitrificationofy6hadnoeffectonaerobicdenitrification.Keywords：heterotrophicnitrification-aerobicdenitrification；marinebacterium；Klebsiellasp.y6；Simultaneousremovalofnitrogenandcarbon随着社会的发展,水污染的防治越来越受到人们的重视.如何解决氮元素过剩所引起的水体富营养化是治理水污染的重要方面.随着科技的进步,生物脱氮以其高效、经济、简便的特性,已经成为去除水中氮元素的主要手段.但是,传统的生物脱氮分为好氧硝化阶段和缺氧反硝化阶段,要求在两个反应器中进行,建设成本高[1],而且自养硝化菌的成长速度缓慢.近年来,通过发现具有异养硝化—好氧反硝化特性的菌株(ParacoccuspantotrophusATCC35512),而提出异养硝化—好氧反硝化菌的概念[2].在之后的时收稿日期：2016-06-23基金项目：国家自然科学基金资助项目(51278258;51478229);山东省自然科学基金资助项目(BS2015HZ007);山东省高等学校科技计划项目(J15LC61)*责任作者,教授,[e-mail]2期王骁静等：海洋异养硝化-好氧反硝化菌y6同步脱氮除碳特性687间里,越来越多的类似这种性质的菌株被发现.HN-AD菌具有生长速度快、同步脱氮除碳、在一个反应器中完成硝化和反硝化两个过程、占地面积少等特点[3],引起国内外的重视,成为研究的热点.目前,工业排放的含氮废水盐度都较高,高盐度使得微生物中脱氢酶的活性下降[4],影响微生物的生长代谢,渗透压升高会导致细菌细胞质壁分离甚至破裂死亡.现阶段国内外主要从地表水、土壤和生活工业废水中分离出HN-AD菌,研究较多的是在低盐废水中HN-AD菌的生长以及同步脱氮除碳特性,对高盐环境中的HN-AD菌鲜有报道[5].因此,本实验研究在海洋条件下微生物的异养硝化-好氧反硝化脱氮特性更具有现实意义.本研究从胶州湾海底沉积物中分离筛选了一株海洋HN-AD菌y6.对其形态、生理生化以及16SrRNA序列进行了研究分析.考察了在海水环境中菌株y6生长的最佳碳源、pH值以及C/N,并分析了在单一和混合氮源环境下的同步脱氮除碳效果,以期丰富高盐条件下的生物脱氮除碳机制,为高盐废水生物处理的实际应用提供了理论依据和支持.1材料与方法1.1菌株来源、培养基和细菌鉴定菌株来源、培养基的配制以及细菌鉴定实验方法参照本实验室近年来的研究成果[6],在此基础上进行了改进.HN-AD培养基:KH2PO40.2g,K2SO40.1g,NH4Cl0.19g,KNO20.36g,柠檬酸三钠6.944g,微量元素溶液Ⅰ、Ⅱ各1.25mL,海水1000mL,pH7.0.在相应实验中,对HN-AD培养基中的碳源和氮源做出相应的调整.1.2影响菌株y6的生长因素本实验选择的生长因素为碳源、初始pH值和C/N3项,碳源分别为乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸三钠、蔗糖和葡萄糖,初始pH值设为5.0、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9,C/N(培养基中COD与总氮的比)为1、5、9、13、17、21、25.设置NH4Cl和KNO3的初始量为50mg/L,总氮为100mg/L.以HN-AD培养基为基础,设置单一变量,碳源为柠檬酸三钠,初始pH值为7,C/N为17.将处于对数生长期的活化菌液按照8%的接种量(吸取8mL)接种到经过高温灭菌的液体培养基中.置于气浴恒温振荡器(转速140r/min,温度30℃)中,培养20h后检测培养基中菌体的生长量(OD600),以及NH4+_N、NO2-_N、NO3-_N和COD的含量.考察不同生长因素对菌株y6脱氮效果的影响,选出适宜菌株y6生长的最佳碳源、初始pH和C/N.1.3菌株y6的脱氮特性研究依照HN-AD培养基,选碳源为柠檬酸三钠,初始pH值为7.0,C/N为17,配菌株y6的脱氮性能培养基.分别设置单一氮源系统和混合氮源系统,考察菌株y6的HN-AD能力.菌株y6的脱氮性能实验设计如表1:表1菌株y6的脱氮性能实验设计Table1Theexperimentaldesignondenitrificationperformanceofstrainy6氮源比例TN(mg/L)碳源(柠檬酸三钠)(mg/L)单一碳源NH4Cl无1001700KNO3无1001700NaNO2无1001700混合KNO3:NaNO21:11001700混合KNO3:NaNO21:21502550混合KNO3:NaNO21:32003400混合KNO3:NaNO22:11502550混合KNO3:NaNO23:12003400混合NH4Cl:KNO31:11001700混合NH4Cl:KNO31:21502550混合NH4Cl:KNO31:32003400混合NH4Cl:KNO32:11502550混合NH4Cl:KNO33:12003400混合NH4Cl:NaNO21:11001700混合NH4Cl:NaNO21:21502550混合NH4Cl:NaNO21:32003400混合NH4Cl:NaNO22:11502550混合NH4Cl:NaNO23:12003400混合NH4Cl:KNO3:NaNO21:1:115025501.4分析方法NH4+_N:钠氏试剂分光光度法;NO2-_N:N-(1-萘基)乙二胺分光光度法;NO3-_N:麝香草酚分光光度法;菌体生长量(OD600):测定菌液在600nm波长时的吸光度值;pH值和ORP使用688中国环境科学37卷WTWpH/Oxi340i/SET测定;COD:碱性高锰酸钾法.3次重复实验取平均值.2结果与讨论2.1菌株形态特征与生理生化鉴定菌株y6在分离和生长固体培养基上培养15h后,形成的菌落呈乳白色,不透明,边缘整齐,表面隆起,易挑取.菌株y6大小为1.1µm×0.7µm,为短杆菌,没有鞭毛和芽孢.菌株y6的生理生化鉴定结果可知,菌株y6氧化酶反应阴性,水解酶反应、甲基红实验以及吲哚实验均呈现阳性.生理生化指标与摩根氏菌有99.93%的相似性.对于鸟氨酸、葡萄糖、丙二盐、色氨酸等大分子有机底物,该菌株y6均能进行水解利用,说明菌株y6有相应的酶系统.2.2y6菌株16SrRNA测序及系统发育分析对菌株y6测序获得长度为1416bp的部分16SrRNA序列.将所得的菌株序列提交至GenBank中通过Blast检索,应用MEGA6软件,以Neighbor-joining法绘制系统发育树,从菌株y5的系统发育树上可以看出,菌株y6与多株Klebsiellasp.16SrRNA的相似性达99%,结合菌株的形态特征和生理生化特性