含油废水中一株高效油脂降解菌的筛选和鉴定

生态环境学报2010,19(6):[e-mail]基金项目：山东省908专项(SD908-01-01-05：06)；国家高技术研究发展计划(863)项目(2007AA09Z416)；中国海洋大学研究训练计划(OUC-SRTP)资助项目(0811010504)作者简介：游偲(1987年生)，女，硕士研究生，主要从事微生物生态学方面研究。E-mail：[e-mail]*通讯作者：E-mail:[e-mail]收稿日期：2010-04-27含油废水中一株高效油脂降解菌的筛选和鉴定偲游1，朱琳1，张艳1喆，张2,1，唐学玺1，肖慧1*1.中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛266071摘要：从中国海洋大学餐厅下水道废水中分离、筛选获得9株具有油脂降解能力的菌株。菌株ss-11油脂降解能力最强，在初始筛选条件下其降解率达47.29%。对ss-11的降解条件进行初步研究，结果表明，在初始豆油量为1.0mL·L-1，初始pH为7.5，摇床转速为140r·min-1，37℃下培养72h，该菌的油脂降解率达87.55%。通过菌落形态、生理生化特征、16SrDNA序列系统发育分析，将其鉴定为产酸克雷伯氏菌（Klebsiellaoxytoca）。关键词：油脂降解菌；产酸克雷伯氏菌；16SrDNA；系统发育分析中图分类号：X703文献标识码：A文章编号：1674-5906（2010）06-1378-05随着我国经济的迅速发展，油脂加工厂以及餐饮业排出的油脂废水量日益增多。直接排放的油脂废水会飘浮于水体表面，影响水体的复氧及其自然净化过程，危害水生生态系统，严重污染周围环境[1-2]。目前，油脂废水的处理方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法和化学法由于投资大，占地广，流程复杂，且容易产生二次污染，实际应用较少[3]。而生物法处理油脂废水，主要利用油脂废水中的微生物具有一定的油脂降解能力，能将油脂作为碳源和能源，并通过微生物生长过程中产生的脂肪酶等降解酶系的作用将油脂水解为甘油、脂肪酸，最终分解氧化为水和二氧化碳等代谢产物[4-5]；整个处理过程投资小，成本低，效率高且无二次污染，现已成为国内外研究的热点[6-8]。我国对油脂废水的生物处理主要采用活性污泥法，然而传统使用的活性污泥对含油废水的直接处理能力较低、效果差[9]。因此从自然环境中筛选高效油脂降解菌，采用投菌法对活性污泥加以改善，对处理油脂废水具有重要意义。1材料与方法1.1材料1.1.1样品来源采自中国海洋大学鱼山校区快餐厅后下水道。1.1.2培养基富集培养液：NaCl0.5g，蛋白胨5.0g，牛肉膏0.5g，豆油按周期加入，pH7.0～7.5，蒸馏水1000mL。121℃灭菌20min。中性红培养基：牛肉膏蛋白胨培养基加豆油10mL，0.6%中性红水溶液1mL。121℃灭菌20min。选择培养液：蛋白胨1.0g，NH4NO30.2g，K2HPO40.5g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.1g，豆油1.0mL，pH7.2～7.4，蒸馏水1000mL。121℃灭菌20min。1.2方法1.2.1驯化将采集到的样品用无菌水10倍稀释后充分混合，制成样液。取5mL样液到45mL富集培养液中，30℃，140r·min-1条件下震荡培养，并同时做3个平行样。每2d观察，若油脂降解效果好则适量补加豆油。每6d为1周期，接种10mL菌液到40mL新培养液中以促进菌株的生长，驯化持续5个周期。初始加油量随周期逐次递增，分别为0.8，1.6，2.4，3.2，4.0mL·L-1。1.2.2油脂降解菌的分离从驯化样中选取油脂分解较充分的菌液，以最佳稀释浓度10-5稀释涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃培养48h。挑选不同形态特征的菌落，划线纯化培养。1.2.3油脂降解菌的筛选将纯化后的菌株接种于中性红培养基上，观察菌落周围是否变红，若变红则表明菌株能够分解油脂产生脂肪酸[10]。将初筛入选的菌株接种到以豆油为唯一碳源的选择培养液中，30℃，140r·min-1条件下培养72h，用紫外分光光度法[11]测定样品在225nm波长下的吸光度值，同时以豆油为溶质石油醚为溶剂，测定不同豆油浓度的吸光度值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算含油量以及各菌株的油脂降解率，选取降解率最高的菌株作进一步研究。游偲等：含油废水中一株高效油脂降解菌的筛选和鉴定13791.2.4降解特性初步研究从入选的菌种中挑取一环新鲜斜面种子，接种到不同初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的选择培养液中，140r·min-1条件下培养72h，测定油脂降解率，获得最适降解pH值。同理，设定不同培养温度：17、22、27、32、37、42℃，在最适pH值、140r·min-1条件下培养72h，获得最适降解温度，以及该条件下最佳降解率。1.2.5菌落形态观察及生理生化特性研究在牛肉膏蛋白胨培养基上观察入选菌株的菌落特征，并对菌株进行一系列常规的生理生化实验[12][13]，初步确定菌株的分类地位。1.2.616SrDNA基因扩增及序列分析采用CTAB法[14]提取细菌总DNA。利用细菌16SrDNA扩增通用引物27F和1492R进行PCR扩增。25μL反应体系中含有：10×PCR缓冲液2.5μL，1.5mmol·L-1MgCl21.5μL，4×dNTP混合物2μL，引物各1μL，2.5U·μL-1的TaqDNA聚合酶0.2μL，模板DNA1μL，加无菌双蒸水补至25μL。PCR反应条件为：96℃预变性6min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后72℃温育6min。扩增后的16SrDNA纯化后由上海桑尼生物公司测序，测得的序列提交到GenBank并在国际生物技术信息网中心（NCBI）数据库（）中进行序列同源性分析，使用ClustalX1.8软件与从GenBank数据库中获得的16SrDNA序列进行多序列比较，Mega3.0软件中NJ法（邻接法）构建16SrDNA系统发育树，bootstrap检验，重复1000次，确定该菌的分类地位。2结果与分析2.1菌株分离及筛选从中国海洋大学鱼山校区快餐厅下水道采集到的样液中经1个月富集驯化共分离得到12株细菌，编号ss-1~ss-12。分离得到的菌株经中性红培养基培养，发现其中9株细菌菌落周围明显变红，初步断定这9株菌能够分解油脂产生脂肪酸，具有一定油脂降解能力。将初筛获得的菌株接种到选择培养液中培养72h后，测定含油量，计算油脂降解率。获得的标准曲线如图1，得到回归方程：Y=0.5066x+0.0007，R2=0.9999；各菌株的油脂降解率如图2所示。从图2可以看出菌株ss-11的油脂降解率最高，达到47.29%，因此选取该菌株做进一步研究。2.2菌株降解条件研究结果2.2.1最适降解pH值相同温度下，培养基的初始pH值对细菌的生长繁殖具有很大影响，每种细菌都有适合生长的最适pH，且只能在一定pH条件下生长繁殖。菌株ss-11在不同pH的选择培养液中培养72h后对油脂的降解率如图3所示。图3表明：pH值能显著影响菌株ss-11对油脂的降解率，菌株在pH为5.0~9.0范围内均能降解油脂。当pH值为7.0~8.0时菌株对油脂的降解率较高，几乎达50%，pH过高过低，降解率都会降低，当pH为5.0时，降解率不足20%。2.2.1最适降解温度温度影响着微生物体内一系列生物化学反应，y=0.5066x+0.0007R2=0.99990.0000.1000.2000.3000.4000.5000.60000.20.40.60.811.2φ/(µL•mL-1)吸光度值OD225图1标准曲线Fig.1Standardcurve0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.00ss-1ss-2ss-3ss-5ss-6ss-8ss-9ss-10ss-11菌株编号降解率/%aabcdbbcae数据表示平均值±标准差（n=3），不同字母代表在0.05水平上差异显著（LSD）检验。图2各菌株的油脂降解率Fig.2Oil-degradingrateofvariousstrains0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.005.06.07.08.09.0pH降解率/%abccd降解率数据表示平均值±标准差（n=3），不同字母代表平均值在0.05水平上差异显著（LSD）检验图3初始pH对降解率的影响Fig.3EffectofinitialpHvalueondegradationrate1380生态环境学报第19卷第6期（2010年6月）它对生物有机体的影响表现在两个方面：一方面，随着温度的上升，细胞中的生物化学反应速率和生长速率加快；另一方面，机体的重要组成如蛋白质、核酸和催化反应的酶等对温度都很敏感，随着温度的增高可能受到不同程度地破坏。因此，合适的温度对菌种性能至关重要。菌株ss-11在pH为7.5，不同温度条件下培养72h后对油脂的降解率如图4。图4表明：温度对菌株ss-11的油脂降解率影响显著。在本实验所设的温度范围内，菌株ss-11均能降解油脂；在37.0℃时降解率最高，达87.55%。随着温度上升或下降，降解率均有较大程度的下降，温度为当温度为17.0℃，降解率仅为20%。即得出结论：在初始豆油浓度为1.0mL·L-1，初始pH为7.5，摇床转速为140r·min-1，37℃下培养72h，该菌的油脂降解率达87.55%。2.3菌落形态及生理生化实验鉴定结果菌落光滑呈圆形，较大，湿润，中间隆起，不透明，灰白色，无核，边缘整齐。菌株成杆状，不运动，兼性厌氧，革兰氏染色阴性。葡萄糖产酸产气、淀粉水解等实验结果见表1。根据细菌的菌落形态以及生理生化实验结果，结合《常见细菌系统鉴定手册》[12]以及《伯杰细菌鉴定手册》（第8版）[13]中相关描述，可将菌株ss-11鉴定为克雷伯氏菌属（Klebsiella）。2.4菌株ss-11的16SrDNA基因序列以菌株ss-11的DNA为模版，扩增菌株的16SrDNA基因序列，得到长约1500bp的16SrDNA片段，如图5所示。扩增片段经测序，测得其长度为1425bp，其GenBank序列号为GU993916。2.5系统进化树分析将ss-11的序列提交Genbank数据库，并与数据库中序列进行Blast比对，其序列与产酸克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca同源性达99%。选取6株同源性较高的菌株序列，再选取3株Klebsiella的其它菌株序列进行多序列比对，构建系统发育树，如图6所示。由16SrDNA基因序列比较可知，菌株与K.oxytoca亲缘关系最接近。结合菌落形态观察及生理生化实验结果，将菌株ss-11鉴定为产酸克雷伯氏菌（K.oxytoca）。0.0020.0040.0060.0080.00100.0017.022.027.032.037.042.0t/℃降解率/%eabcddc降解率数据表示平均值±标准差（n=3），不同字母代表平均值在0.05水平上差异显著（LSD）检验图4温度对降解率的影响Fig.4Effectoftemperatureondecomposingrate图6根据16SrDNA基因序列构建的ss-11系统发育树Fig.6Phylogenetictreebasedon16SrDNAgenesequenceanalysis表1菌株ss-11的生理生化特征Table1Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofss-11项目ss-11项目ss-11鞭毛染色-接触酶+芽胞染色-吲哚产生+葡萄糖产酸产气++硝酸盐还原