杭州湾水环境中氨氧化微生物对外源氨氮的响应

908北京大学学报(自然科学版),第49卷,第5期,2013年9月ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisPekinensis,Vol.49,No.5(Sept.2013)杭州湾水环境中氨氧化微生物对外源氨氮的响应孙仁华温东辉†北京大学环境科学与工程学院,北京100871;†通信作者,E-mail:[e-mail]摘要采集杭州湾邻近工业园区纳污水域靠近排污点(A点)及远离排污点(B点)的沉积物和水样,进行实验室模拟培养实验。在外源氨氮的刺激下,培养体系中微生物氨氧化作用加强,35天后水中投加的NH4+-N全部被去除,而NO3−-N出现积累。源于A,B点的样品在培养实验后,基于细菌氨单加氧酶基因(Bact-amoA)的DGGE指纹图谱中的条带数由1条分别增加至7条和5条,表明氨氧化细菌的群落结构发生变化,多样性增加;而基于古菌氨单加氧酶基因(Arch-amoA)的DGGE条带数没有明显变化,表明氨氧化古菌的群落结构没有显著变化。关键词氨氧化细菌;氨氧化古菌;氨氧化;外源氨氮中图分类号X172ResponsestoExternalAmmoniumSourcebytheAmmoniaOxidationMicroorganismsfromHangzhouBaySUNRenhua,WENDonghui†CollegeofEnvironmentalSciencesandEngineering,PekingUniversity,Beijing100871;†Correspondingauthor,E-mail:[e-mail]ivationwascarriedoutinlab,usingthesedimentandseawatersamplescollectedfromthedischarge-receivingseanearanindustrialparkinHangzhouBay.Thesampleswerecollectedfromtwosites—onewasneartotheoutlet(siteA)andtheotherwasfarfromtheoutlet(siteB).Ammoniaoxidationwasstimulatedandenhancedbytheadditionofammoniuminthesediment-seawatermicrosystems.After35-daycultivation,alloftheexternal+4NH-Nwasremoved,but3NO−-Naccumulatedintheaqueoussolution.ThePCR-DGGEdetection,basedontheammoniamonooxygenasesubunitA(amoA)gene,showedthatammoniaoxidationwascoupledwithbacterialinsteadofarchaealpattern.Undertheshockloadofammonium,thenumbersofBact-amoAbandsincreasedfrom1to7(siteA)and5(siteB),indicatingthattheabundanceofammoniaoxidationbacteria(AOB)increased.However,theArch-amoAbandsstayedthesame,whichshowedthatthecommunitystructureofammoniaoxidationarchaea(AOA)keptunchanged.Keywordsammoniaoxidationbacteria(AOB);ammoniaoxidationarchaea(AOA);ammoniaoxidation;externalammonium氨氧化反应作为硝化反应的限速步骤,是废水处理工艺中总氮去除和生物圈中氮循环的关键环节,一直是研究者关注的热点。长期以来,研究者普遍认为氨的氧化过程主要由氨氧化细菌(ammoniaoxidationbacteria,AOB)完成,传统废水处理的硝化工艺也依据AOB的生理生化特性而设计和运行[1]。AOB都拥有amoA基因,这一基因是编码氨氧化作用的关键酶——氨单加氧酶的功能基因。然而近期的检测发现,一些古菌也具有类似的功能基因。研究者对具有氨氧化功能的古菌(即氨氧化古菌,ammoniaoxidationarchaea,AOA)的分离和培养研究,进一步证实了其氨氧化潜力[2]。AOA广泛存在国家自然科学基金(51178002)资助收稿日期:2012-12-14;修回日期:2013-01-09;网络出版日期:2013-06-27网络出版地址:第5期孙仁华等:杭州湾水环境中氨氧化微生物对外源氨氮的响应909于自然环境和人工环境中,如大洋[3]、海滨[4]、河口[5]、海湾[6]、土壤[7]、废水生物反应器[8]等,在某些环境中,其丰度甚至高于AOB[3,7],这使人们对传统的氨氮转化理论有了全新的认识。近年来,AOA已成为微生物氮循环机理研究的前沿领域。虽然AOA在氨氮转化中的重要作用逐渐得到广泛认同,但AOB和AOA在不同环境条件下对氨氮转化的贡献率仍不清楚。2006年Leininger等[7]首次报道了细菌和古菌关键功能基因amoA的相对丰度,发现土壤中AOA有可能是AOB的3000倍之多。Wuchter等[9]的研究结果显示,海洋中古菌amoA基因的拷贝数要高出细菌amoA基因1~3个数量级。Wu等[10]研究了太湖沉积物中氨氧化微生物的构成,发现在这个富营养化的水体中,除了东部太湖湾,其他位点AOA的数量都远大于AOB。然而,功能基因分析有时并不能完全反映氨氧化酶的活性,基因拷贝数多并不一定代表对氨氮的转化潜力高[11]。Shen等[12]的研究表明,施加氮肥可以引起土壤AOB菌群的明显改变,而AOA菌群变化不大。Jia等[13]和武传东等[14]的研究也有类似的结论。对于水环境而言,由于沉积物−水体界面之间存在氮交换,使得对该环境中氮转化的研究变得更复杂,目前尚缺乏针对这一复杂系统中外来氮源刺激对氨氧化微生物影响的研究。杭州湾地区是长三角经济区的重要组成部分,人口稠密,沿岸布局了化工、医药、纺织等多个工业园区,每年向杭州湾排入大量的工业废水,是陆源氮污染的重要来源之一,杭州湾也是我国富营养化程度最高的海域之一。入湾河流裹携大量泥沙,沿岸城镇和企业排水携带大量污染物进入杭州湾,成为影响杭州湾水质的重要因素。本研究选取杭州湾靠近上虞工业园区的纳污水体为研究对象,采集湾区沉积物样品及水样,在实验室开展环境样本中氨氧化微生物对外源氨氮响应的研究,通过水中氮素分析和PCR-DGGE技术,揭示在氨氮转化过程中AOB和AOA的作用,以及AOB及AOA菌群对外源氨氮的响应。研究结果将揭示沉积物−水体系中氨氧化微生物在氨氮污染冲击下的群落变化,为受污染水体的生物修复提供理论依据。1材料与方法1.1样品采集实验样品于2012年8月24日平潮期采自杭州湾邻上虞工业园区的水域,该水域亦为上虞污水处理厂的总排污口所在水域。杭州湾区域海流流向及采样水域具体位置如图1所示。在该水域选取近排污点(A点,N30°12.880′E120°51.516′,距排污口约30m)及远排污点(B点,N30°12.820′E120°51.151′,距排污口约600m),用抓斗采泥器采集A,B两点处沉积物表层样品,用自封袋装好。用采水器采集各采样点沉积物上覆水约5L,装入采样瓶中。样品采集后转移至实验室,于4℃保藏。1.2水样理化性质及分析方法对采集的水样测定盐度、pH、溶解氧(DO)、化学需氧量(COD)、氨氮(NH4+-N)、硝酸盐氮(NO3−-N)、亚硝酸盐氮(NO2−-N)、总氮(TN)、总磷(TP)等多项指标。盐度、pH和DO分别使用盐度计(MettlerToledo,瑞士)、pH计(Thermo,美国)和DO仪(Thermo,美国)于现场测定。COD采用碱性高锰酸钾法进行测定;NH4+-N,NO3−-N,NO2−-N,TN,TP分别使用靛酚蓝法、锌镉还原法、萘乙二胺法、碱性过硫酸钾氧化法、过硫酸钾氧化法进行测定(GB17378.4—2007海洋监测规范第4部分:海水分析),使用紫外−可见光分光光度计(岛津UV-2401PC,日本)测量。水样基本理化性质总结于表1。图1杭州湾地区(a)采样水域示意图(b)Fig.1StudyingareainHangzhouBay(a)andthesamplingsitesinthatarea(b)北京大学学报(自然科学版)第49卷910表1采样点水样的理化性质Table1PhysicochemicalpropertiesofwatersamplesfromsiteAandB浓度/(mg·L−1)采样点pH盐度/psuDOCODNO2−-NNH4+-NNO3−-NTNTPA7.852.663.692.880.00520.4083.234.640.0638B7.882.393.692.580.00290.2983.114.550.06701.3投加外源氨氮的培养实验将在采样点采集的6g沉积物样品(平均含水率为22%)和50mL水样放入150mL锥形瓶中,形成一个沉积物−水微培养系统。将锥形瓶置于25℃的摇床中以80r/min的低速震荡,使系统在培养过程中保持有氧状态,模拟杭州湾受污染的沉积物−水环境。将A,B点采集到的样品进行分装,并分别设置实验组和对照组。向实验组的瓶中加入外源氨氮——浓度为1g/L-N的(NH4)2SO4溶液,而对照组不加入任何外源氨氮。于实验开始时(第0天)加入100μL(NH4)2SO4溶液,进行适应性培养,于第7和14天各加入500μL(NH4)2SO4溶液,进行高氨氮的强化培养,3次共加入1.10mgNH4+-N。分别于培养的第0,7,14,21,28和35天进行采样,每组每次采样都设置3个平行。将水样经0.45μm滤膜过滤后测定水中NH4+-N和NO3−-N浓度,沉积物样品收集后进行DNA的提取和amoA基因的电泳分离。1.4PCR-DGGE分析将培养的沉积物−水体系中的全部沉积物采用强力土壤DNA提取试剂盒(Mobio,美国)提取总DNA,提取方法参照试剂盒说明书。使用DNA浓度分光光度计(Eppendorf,德国)测定所提出的DNA浓度。针对AOB和AOA的amoA基因进行PCR,PCR的引物和程序如表2所示。为了减少PCR误差,每个DNA样品做3个PCR平行,PCR产物纯化后采用DCode突变检测系统(Bio-rad,美国)进行DGGE分析。聚丙烯酰胺变性梯度胶质量分数为6%,使用变性梯度为30%~70%的胶检测AOBamoA基因,使用变性梯度为20%~50%的胶检测AOAamoA基因,温度60℃,电压90V,l×TAE缓冲液中电泳700min后,用GElRED染色液染色40min,于紫外灯下拍照检测。检测结果用QuantityOne软件分析。2结果与讨论2.1水中氨氮浓度变化模拟培养实验中,水中NH4+-N浓度的变化如图2所示,图中3个箭头分别代表3次外源氨氮的添加。在实验过程中,对照组水中NH4+-N浓度没有变化,实验组水中NH4+-N浓度经历了一个先升高后下降的过程。第一次外源氨氮投加7天后,水中的NH4+-N浓度回复到初始浓度,这说明投加的NH4+-N从水体中转移,可能为沉积物吸附以及微生物利用和转化。第二、三次外源氨氮投加后,水中NH4+-N浓度显著升高,随着时间推移才逐渐降低,这可能是由于投加量较大,短时间内超出系统的利用和转化能力,因此在一定时期内水中出现NH4