好氧反硝化菌脱氮特性研究进展

好好氧反硝化菌脱氮特性研究进展*梁书诚摇赵摇敏**摇卢摇磊摇赵丽艳(东北林业大学生命科学学院,哈尔滨150040)摘摇要摇好氧反硝化菌的发现,是对传统反硝化理论的丰富与突破.由于其在脱氮方面的独特优势,已成为目前废水生物脱氮领域研究的热点.好氧反硝化菌能够在有氧条件下,利用有机碳源生长的同时将含氮化合物反硝化生成N2等气态氮化物,多数还能同时进行异养硝化作用,将铵态氮直接转化为含氮气体.本文从电子理论、反硝化酶系等方面对目前已分离出的一些好氧反硝化菌的脱氮特性及其脱氮机理进行探讨,分析了溶解氧、碳源类型及C/N等环境条件对其脱氮作用的影响,介绍了好氧反硝化菌的筛选方法及应用现状,对其应用前景和发展方向进行了展望.关键词摇好氧反硝化菌摇反硝化酶摇脱氮特性摇作用机理摇异养硝化文章编号摇1001-9332(2010)06-1581-08摇中图分类号摇Q939.9摇文献标识码摇AResearchadvancesindenitrogenationcharacteristicsofaerobicdenitrifiers.LIANGShu鄄cheng,ZHAOMin,LULei,ZHAOLi鄄yan(CollegeofLifeSciences,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China).鄄Chin.J.Appl.Ecol.,2010,21(6):1581-1588.Abstract:Thediscoveryofaerobicdenitrifiersistheenrichmentandbreakthroughoftraditionaldenitrificationtheory.Owingtotheiruniquesuperiorityindenitrogenation,aerobicdenitrifiershavebecomeahotspotinthestudyofbio鄄denitrogenationofwastewater.Underaerobicconditions,theaerobicdenitrifierscanutilizeorganiccarbonsourcesfortheirgrowth,andproduceN2fromnitrateandnitrite.Mostofthedenitrifierscanalsoproceedwithheterotrophicnitrificationsimultaneously,transformingNH4+鄄Ntogaseousnitrogen.Inthispaper,thedenitrogenationcharacteristicsandac鄄tionmechanismsofsomeisolatedaerobicdenitrifierswerediscussedfromtheaspectsofelectronthe鄄oryanddenitrifyingenzymesystem.TheeffectsoftheenvironmentalfactorsDO,carbonsources,andC/Nonthedenitrogenationprocessofaerobicdenitrifierswereanalyzed,andthescreeningmethodsaswellasthepresentandpotentialapplicationsofaerobicdenitrifiersinwastewatertreat鄄mentweredescribedanddiscussed.Keywords:aerobicdenitrifier;denitrifyingenzyme;denitrogenationcharacteristics;actionmecha鄄nism;heterotrophicnitrification.*国家自然科学基金项目(30671702)资助.**通讯作者.E鄄mail:[e-mail]2009鄄09鄄29收稿,2010鄄04鄄11接受.摇摇在氮的生物地球化学循环中,反硝化作用是其中重要的环节.传统脱氮理论认为要实现废水生物脱氮必须是铵态氮经历典型的硝化与反硝化过程,即废水中的铵态氮首先被氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌在好氧条件下依次氧化为亚硝酸盐氮、硝酸盐氮,然后由反硝化细菌在厌氧或兼氧条件下将硝酸盐氮还原为氮气或氮氧化物[1].传统认识上的反硝化菌在有氧条件下优先利用氧气作为电子受体,只有在缺氧条件下硝酸盐才会代替氧气作为最终电子受体,进行反硝化作用.近几年,新型脱氮生物的陆续发现,使人们对于氮循环又有了新的认识.好氧反硝化菌的发现就是其中之一,好氧反硝化菌是在有氧条件下,利用好氧反硝化酶进行反硝化作用的一类脱氮菌[2].它的发现打破了反硝化只能在缺氧或厌氧条件下进行的传统观点,为新型生物脱氮提供了新思路.本文从好氧反硝化菌的脱氮特性、作用机理及影响因素等方面对好氧反硝化菌的研究进展和应用现状进行了综述.1摇好氧反硝化菌的发现及其脱氮特性关于好氧反硝化菌的研究始于20世纪80年代,Robertson和Kuene[3]在除硫和反硝化处理系统中首次分离到好氧反硝化菌Thiosphaerapantotropha应用生态学报摇2010年6月摇第21卷摇第6期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇ChineseJournalofAppliedEcology,Jun.2010,21(6):1581-1588(现更名为Paracoccuspantotrophus)、Pseudomonasspp.及Alcaligenesfaecalis.之后很多人采用类似的方法筛选出了此类脱氮菌[4-5].近几年,随着对好氧反硝化作用的日益关注,陆续有很多具有好氧反硝化能力的新菌株被报道,如Klebsiellapneumoniae[6]、Comamonastestosteroni[7]、Pseudomonasputida[8].现已报道的好氧反硝化细菌大多分布在假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)和产碱菌属(Alcaligenes)等土壤、废水常见菌属中,其具体脱氮特性详见表1.2摇好氧反硝化作用机理及影响因素目前,关于好氧反硝化菌的作用机理主要是通过对经典好氧反硝化菌株Thiosphaerapantotropha的研究得到的,现被大多数学者认同的好氧反硝化机理是由Robertson等[27]提出的协同呼吸理论.协同呼吸意味着在反硝化过程中,分子氧和硝酸盐同时作为最终电子受体,即反硝化菌可以将电子从被还原的物质传递给氧气,同时也可以传递给硝酸盐.在细胞色素c和细胞色素aa3之间的电子传递链中的“瓶颈现象冶就可以克服.因此也就允许电子流同时传输到反硝化酶以及分子氧中,反硝化反应就可能在好氧环境中发生.根据Wilson等[28]提出的细菌反硝化过程电子传递模型(图1)可以看出,NO3-和O2均可作为电子最终受体,反硝化菌可将电子从被还原的物质传递给O2,同时也可通过硝酸盐还原酶将电子传递给NO3-.图1摇细菌反硝化过程电子传递模型(根据[28]更改)Fig.1摇Electrontransportchainofbacteriadenitrification(adaptedfrom[28]).NR:硝酸盐还原酶Nitratereductase;Nir:亚硝酸盐还原酶Nitritere鄄ductase;Nor:NO还原酶Nitricoxidereductase;Nos:N2O还原酶Ni鄄trousoxidereductase.2郾1摇好氧反硝化作用酶系由于T.pantotropha好氧反硝化现象发现较早,因此有关好氧反硝化酶系的研究也主要是围绕此菌展开.好氧反硝化过程中主要涉及到的关键酶依次是硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶.2郾1郾1硝酸盐还原酶(nitratereductase,NR)摇在T.pantotropha中表达两种异化性硝酸盐还原酶,即膜质硝酸盐还原酶(membrane鄄boundnitratereductase,NAR)和周质硝酸盐还原酶(periplasmicnitratere鄄ductase,NAP).菌体的好氧生长和厌氧生长直接影响了这两种酶的活性.在缺氧条件下,NAR表达占主导地位,而且仅仅在厌氧条件下才能发挥作用;在好氧条件下NAP表达占主导地位,并且在好氧和厌氧条件下都能发挥作用.厌氧条件下,NAP也会有所表达[29].好氧反硝化的能力被与NAP的表达联系在一起,代替了厌氧反硝化菌通常表达的NAR.氧气被认为通过阻止硝酸盐进入NAR的催化中心而参与调控硝酸盐呼吸作用[30],但NAP的催化活性中心在细胞膜外,因此氧气对硝酸盐鄄亚硝酸盐转运系统的阻碍作用被解除了.研究表明:NAP由一个90kDa的钼喋呤结合催化亚基(NapA)和一个16kDa的细胞色素c552(NapB)构成,后者含有两个血红素基团.与NAR相比,NAP对硝酸根有更高的底物专一性,并对叠氮化物的抑制不敏感[31].2郾1郾2亚硝酸盐还原酶(nitritereductase,NIR)摇亚硝酸盐还原酶是反硝化途径的关键酶.亚硝酸盐至NO的还原反应是反硝化作用区别于其他硝酸盐代谢的标志性反应,该酶的基因也是在反硝化菌功能基因中被研究最多的,已经作为反硝化菌的分子标记而用于其种群结构及多样性的研究[32].亚硝酸盐还原酶分布于细胞膜外周质中,有两种类型:一种为含c和d1型血红素的二聚体,称为Cytcd1型亚硝酸盐还原酶,能将亚硝酸盐转化为NO和NO2;另一种为三聚体,含Cu催化中心,称为Cu型亚硝酸盐还原酶,产物是NO.Moir等[33]从P.pantotropha提纯了Cytcd1型亚硝酸盐还原酶,分子量约为63kDa,并且推测假天青蛋白在体内作为其电子供体.Fulop等[34]发现P.pantotropha中的细胞色素cd1型亚硝酸盐还原酶是一种具有两种截然不同功能的酶,这种酶既可以催化亚硝酸盐得到一个电子还原成NO,又可以催化O2得到4个电子转化成水.由于亚硝酸盐和NO可产生活性氮(RNS),会对细胞产生毒害.Doi等[35]通过对耐高浓度亚硝酸盐菌株2851应摇用摇生摇态摇学摇报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇21卷表1摇好氧反硝化细菌的脱氮特性Tab.1摇Nitrogenremovalcharacteristicsofaerobicdenitrifiers菌属Genus菌株Strain溶解氧Dissolvedoxygen(DO)反硝化速率Denitrificationrate参考文献Reference假单胞菌属Pseudomonas恶臭假单胞菌PseudomonasputidaAD鄄215郾0~6郾0玉2郾9a[8]绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa1郾0~1郾3玉1郾7b[9]施氏假单胞菌PseudomonasstutzeriSU292%域0郾032b[10]施氏假单胞菌PseudomonasstutzeriNS鄄22郾7芋0郾25a[11]假单胞菌属类产碱杆菌PseudomonaspseudoalcaligenesZW2379%~95%域1郾55a[12]门多萨菌PseudomonasmendocinaZW2779%~95%域1郾59a[12]施氏假单胞菌PseudomonasstutzeriTR21郾24玉0郾9e[13]假单胞菌Pseudomonassp郾strainK501郾24玉0郾03e[13]产碱杆菌属Alcaligenes反硝化产碱菌AlcaligenesdenitrificansDCBT25F0郾092b[5]Alcaligenessp郾STC110%域6郾67a[14]副球菌属Paracoccus脱氮副球菌ParacoccusdenitrificationsDSM294430%域1郾38c[15]Paracocc