好氧反硝化细菌YX6特性及鉴定分析安健

中国水产科学JournalofFisherySciencesofChina第17卷第3期2010年5月Vol.17No.3May2010收稿日期：2009-11-23；修订日期：2010-01-19.基金项目：国家公益性行业专项（nyhyzx07-042）；国家公益性行业专项（NYCYTX-49-17）；农业部行业专项（200803013）.作者简介：安健（1983-），男，硕士研究生，主要从事水产微生态制剂研发.E-mail：[e-mail]通讯作者：杨先乐（1948-），教授，博士生导师，主要从事水产动物免疫、鱼类药理学与渔药的检测与监控等研究.E-mail：[e-mail]好氧反硝化细菌YX-6特性及鉴定分析安健1，2，宋增福1，杨先乐1，胡鲲1，路怀灯2，佘林荣3（1.上海海洋大学水产与生命学院，国家水生动物病原库，上海201306；2.扬州绿科生物技术有限公司，江苏扬州225600；3.广东海富药业有限公司，广东潮州515700）摘要：从对虾池塘筛选得到1株高效的好氧反硝化细菌，命名为YX-6。对该菌生长及反硝化性能间的关系进行研究；同时研究了不同温度、pH、盐度及碳源对该菌生长及反硝化性能的影响。结果表明，该菌反硝化作用主要发生在对数生长期，可将亚硝酸盐氮由10mg/L降至0；该菌昀适生长及反硝化温度为30℃；pH值范围为7～9时昀适于该菌生长及反硝化性能的发挥。该菌昀适盐度范围为0～15；丁二酸钠、乙酸钠为该菌生长及反硝化的昀适碳源。通过对YX-6菌株生理生化及16SrRNA分子鉴定，初步鉴定为凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans）。对该菌株亚硝酸还原酶基因进行序列分析，结果表明，该菌含有亚硝酸还原酶nirS基因。[中国水产科学，2010，17（3）：561-569]关键词：好氧反硝化；凝结芽孢杆菌；16SrRNA；亚硝酸还原酶基因中图分类号：S94　　　　　　文献标识码：A　　　　　　　文章编号：1005-8737-（2010）03-0561-09目前中国主要采取高密度集约化的养殖生产模式，水体中过量的饲料残渣及水产动物代谢物的排放，常常会导致水体亚硝酸盐氮的严重超标，并有可能进一步诱发细菌病、病毒病等病害，给水产养殖业造成巨大的经济损失。因此，养殖水体亚硝酸盐氮的有效去除是水产业亟需解决的问题之一。好氧反硝化细菌能够在有氧条件下，将N-O3或N-O2还原为N2，是自然界氮素循环的重要途径之一。当前，无论在养殖水体的生产应用还是基础研究方面，氮素消除技术仍然停留在厌氧除氮的初级水平上。由于好氧反硝化细菌的基础研究薄弱，基础数据积累少，制约了好氧反硝化除氮技术的发展。自Robertson等[1]首次分离出好氧反硝化细菌以来，已有较多种类的细菌被报道具有好氧反硝化功能，其中部分菌种能够在高密度养殖条件下，有效地去除水体氮素的过度积累。目前已发现的好氧反硝化细菌主要存在于假单胞菌属（Pseudomonas）[2-3]、产碱杆菌属（Alcaligenes）[4-5]、副球菌属（Paracoccus）[6-7]和芽孢杆菌属（Bacillus）[8-9]等。研究表明，菌株的生长状况会影响反硝化作用效果[10-11]，因此，开展其生物学特性的研究对该类细菌的生产和应用具有重要的理论价值和实际意义。本研究以对虾池塘分离的好氧反硝化细菌YX-6菌株为实验对象，拟在对其部分生物学特性及反硝化性能进行研究的基础上，确定该菌分类学和系统发育地位，旨在为丰富好氧反硝化细菌种质资源的同时，为该菌在养殖水体的实际应用提供理论基础和技术支撑。1材料与方法1.1材料1.1.1　实验菌株好氧反硝化细菌YX-6为本实验室从虾池中分离。562第17卷中国水产科学1.1.2　培养基牛肉膏蛋白胨液体培养基（LB）：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L，pH7.0。反硝化培养基（测定性能）：琥珀酸钠4.72g/L，NaNO20.05g/L，KH2PO41.5g/L，Na2HPO40.42g/L，MgSO4·7H2O1g/L，pH7.2。所有培养基经0.11MPa、121℃灭菌20min。1.2实验方法1.2.1　细菌生长与好氧反硝化性能测定实验菌株经纯培养18h，测其细菌光密度A600约为0.605后，按1%（V/V）菌液添加量接种到200mL反硝化培养基中，30℃、200r/min摇床振荡培养24h，每隔2h取样1次，每次取样10mL，先测定细菌光密度A600，经8000r/min离心取其上清液测定培养液中亚硝酸盐氮的浓度。1.2.2　温度对细菌生长及反硝化性能的影响实验菌株经纯培养18h，测其细菌光密度A600约为0.605后，按1%（V/V）菌液添加量接种到100mL反硝化培养基中，分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下经200r/min摇床振荡培养24h后，取样测定其A600，同时测定其中亚硝酸盐氮的含量。1.2.3　pH对细菌生长及反硝化性能影响实验菌株经纯培养18h，测其细菌光密度A600约为0.605后，按1%（V/V）菌液添加量接种到pH值分别为3、5、7、9、11的100mL反硝化培养基中，30℃、200r/min摇床振荡培养24h后，取样测定其A600，同时测定其中亚硝酸盐氮的含量。1.2.4　盐度对细菌生长及反硝化性能的影响配制盐度为5、10、15、20、25、30的人工海水，并添加反硝化培养基，将纯培养18h后的菌株（光密度A600约为0.605）按1%（V/V）菌液添加量分别接种到100mL反硝化培养基中，30℃、200r/min摇床振荡培养24h后，取样测定其A600，同时测定其中亚硝酸盐氮的含量。1.2.5　不同碳源对细菌生长及反硝化性能的影响将相同物质量的8种碳源添加到反硝化培养基中，取经纯培养18h后的试验菌株悬液，按1%（V/V）菌液添加量分别接种于100mL不同碳源的各反硝化液体培养基中，30℃、200r/min条件下振荡培养24h后取样，测定不同碳源条件下细菌A600值，同时测定其中亚硝酸盐氮的含量。1.2.6　细菌生理生化鉴定采用API50CH鉴定系统进行鉴定。1.2.7　16SrRNA序列分析及系统发育分析用于16SrRNAPCR反应的引物为通用引物，PF：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，PR：5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′，上海基康生物公司合成。PCR反应体系（25μL）：2.5μL10×PCR缓冲液，3.5μLMgCl2，0.5μL模板DNA，0.5μLPF和PR，1μLdNTP，0.5μLTaqDNA聚合酶，16μL超纯水。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。PCR产物连接pMD18-T，转化E.coliDH5α，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒并测序。测序由Invitrogen公司完成。将16SrRNA所测序列通过BLAST检索程序与GenBank中已知16SrRNA序列进行分析，利用CustalX1.8进行序列比对，用MEGA4.0构建系统发育树。1.2.8　亚硝酸盐还原酶基因序列分析参照文献[12]，选取亚硝酸盐还原酶结构基因nirS、nirK特异性引物，对该菌亚硝酸还原酶进行PCR扩增，引物由上海基康生物公司合成。PCR反应体系及条件同1.2.7。PCR产物通过电泳检测及纯化后，由Invitrogen公司测序并进行同源性分析。1.2.9　分析方法亚硝酸盐氮测定：采用N-1萘-乙二胺比色法[13]A600：紫外分光光度计法。1.3数据统计与分析方法实验结果用平均数±标准差（x±SD，n=3）表示，运用软件SPSS.11.0，经One-wayANOVA分析，采用Duncan’s多重检验分析实验结果的差异显著性，P0.05为差异显著。2结果与分析2.1细菌生长与反硝化性能测定结果如图1所示，随着细菌的生长，4h以后细菌得以迅速增殖，此阶段为细菌对数生长期。同时，该菌能够在14h内将初始量为10mg/L的亚硝酸盐氮降解为0，去除率达100%。第3期563安健等：好氧反硝化细菌YX-6特性及鉴定分析2.2温度对细菌生长及反硝化性能的影响如图2所示，随着温度的升高，细菌YX-6生长A600值不断增大，当温度高于20℃时，细菌均能正常生长，且可保持较高的亚硝酸盐氮去除率。温度为30℃时，细菌生长A600值和亚硝酸盐氮去除率均为昀高；在40℃高温时，该菌生长虽相对减缓，但仍然可保持90%以上的亚硝酸盐氮去除率；当温度低于20℃时，细菌几乎无法正常生长，此时亚硝酸盐氮去除率也较低。时间/hTime12108642002468101214161800.20.40.60.81.01.21.41.6A600ρ/（mg·L-1）N02--NA600图1　细菌YX-6生长与亚硝酸盐氮降解曲线Fig.1　DynamicsofYX-6strain’sgrowthanddegradationcurvesofnitritenitrogen图2　不同温度条件下细菌YX-6生长及亚硝酸盐氮降解曲线Fig.2　DynamicsofYX-6strain’sgrowthanddegradationcurvesofnitritenitrogenunderdifferenttemperature2.3pH对细菌生长及反硝化性能的影响如图3所示，细菌在pH值为3～9时均可以正常生长，同时保持较高的反硝化效率。pH值为5～9时，细菌生长A600值仍不断增大，但此pH范围内，细菌对亚硝酸盐氮均可达到近100%的去除率；在pH值为11时，细菌生长极为缓慢，其亚硝酸盐氮去除率也较低。10020406080100120152025303540温度/℃A600去除率/%Removalrate1.800.20.40.60.81.01.21.41.6去除率Removalrate吸光度A600564第17卷中国水产科学2.4盐度对细菌生长及反硝化性能的影响如图4所示，随着盐度的不断增大，细菌生长A600值依次降低。当盐度范围在5～15时，细菌对亚硝酸盐氮的去除率几乎为100%，当盐度超过15时，细菌亚硝酸盐氮去除率逐渐降低。图3　不同pH值条件下细菌YX-6生长及亚硝酸盐氮的降解曲线Fig.3　DynamicsofYX-6strain’sgrowthanddegradationcurvesofnitritenitrogenunderdifferentpHvalue图4　不同盐度条件下细菌YX-6生长及亚硝酸盐氮的降解曲线Fig.4　DynamicsofYX-6strain’sgrowthanddegradationcurvesofnitritenitrogenunderdifferentsalinity2.5不同碳源对细菌生长及反硝化性能的影响结果见表1所示，条件相同，在乙酸钠和丁二酸钠为碳源的反硝化培养基中，细菌A600值昀大，同时细菌对亚硝酸盐氮的去除量也昀大，而该菌对蔗糖、乳酸等碳源的利用率相对较低，菌体生长相对缓慢，反硝化效率偏低。502040608010012010152030盐度SalinityA600去除率/%Removalrate1.800.20.40.60.81.01.21.41.625去除率Removalrate吸光度A600302040608010012057911pHA600去除率/%Removalrate1.800.20.40.60.81.01.21.41.6去除率Removalrate吸光度A600第3期565安健等：好氧反硝化细菌YX-6特性及鉴定分析2.6细菌生理生化鉴定对细菌YX-6进行了50项生理生化指标测试，初步鉴定该菌为凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans）（鉴定结果略）。2.716SrRNA分子鉴定及系统发育分析该菌16SrRNA序列全长1448bp，GenBa