好氧反硝化细菌研究及应用进展王永刚

好氧反硝化细菌研究及应用进展王永刚1，2，3，王旭2，3，张俊娥2，3，董婧2，3，张楠2，3，李明蔚2，3（1.天津大学环境科学与工程学院，天津300072；2.北京市环境保护科学研究院，北京100037；3.国家城市环境污染控制工程技术研究中心，北京100037）［摘要］好氧反硝化菌是一类可利用好氧反硝化酶，在有氧条件下进行反硝化作用的细菌。综述了好氧反硝化作用机理及其酶系统，重点阐述了好氧反硝化菌筛选方法以及已分离获得的好氧反硝化菌类群及生长特性，并介绍了好氧反硝化实际工艺应用情况。同时，归纳总结出相关研究及应用中存在的问题，提出了好氧反硝化的研究方向。［关键词］氨氮；硝酸盐氮；好氧反硝化；异氧细菌［中图分类号］X703［文献标识码］A［文章编号］1005-829X（2017）02-0012-06ProgressintheresearchandapplicationofaerobicdenitrificationbacteriaWangYonggang1，2，3，WangXu2，3，ZhangJun’e2，3，DongJing2，3，ZhangNan2，3，LiMingwei2，3（1.SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering，TianjinUniversity，Tianjin300072，China；2.BeijingUrbanResearchAcademyofEnvironmentalProtectionScience，Beijing100037，China；3.NationalEngineeringResearchCenterforUrbanEnvironmentalPollutionControl，Beijing100037，China）Abstract：Aerobicdenitrifiersareaclassofdenitrifyingbacteriawhichdenitrifywithaerobicdenitrificationenzymeunderaerobiccondition.Theirmechanismsanddenitrificationenzymesystemsaresummarized.Themethodforscreeningaerobicdenitrificationbacteria，theisolatedaerobicdenitrificationbacteriagroupandthegrowthcharacteristicsareexpoundedemphatically.Theactualtechnologicalapplicationsituationofaerobicdenitrifyingbacteriaisintroduced.Meanwhile，theproblemsexistinginrelaventresearchandapplicationareconcludedandsummarized，andresearchdirectionsofaerobicdenitrificationproposed.Keywords：ammonianitrogen；nitratenitrogen；aerobicdenitrification；heterotrophicbacteria［基金项目］水体污染控制与治理科技重大专项（2012ZX07203-001-01）；北京市环境保护科学研究院科技基金项目（2012-B-15）第37卷第2期2017年2月工业水处理IndustrialWaterTreatmentVol.37No.2Feb.，2017传统的生物脱氮是通过氨化、硝化、反硝化作用将有机氮、氨氮经过一系列反应转化为氮气从水中去除的过程，是目前处理含氮废水的主要技术手段〔1〕。反硝化是脱氮中最关键的一步，反硝化细菌是兼性菌，在有氧条件下会优先利用氧进行呼吸，阻止硝酸盐和亚硝酸盐作为最终电子受体；同时氧分子还会对反硝化还原酶产生抑制作用〔2〕，所以反硝化反应一直被认为是一个严格的厌氧过程。而氨化、硝化是需氧反应，因此传统生物脱氮的硝化过程和反硝化过程通常分别在2个反应池中进行，需单独设置缺氧处理单元用于反硝化反应，并保持严格缺氧，以及维持一定的碱度和碳源，这样就增加了污水处理成本和管理难度。为了克服传统反硝化的不足，人们开始研究短程硝化反硝化。首先将硝化过程控制在亚硝化阶段，然后利用厌氧氨氧化菌以氨氮为电子供体、亚硝酸盐氮为电子受体进行反应生成氮气。但是，短程硝化反硝化也存在很多问题，例如短程硝化进程的控制问题、厌氧氨氧化的启动问题以及COD的干扰问题等。为了解决上述问题，一种新型的生物脱氮技术——异养硝化-好氧反硝化（HeterotrophicNitrifi⁃cation-AerobicDenitrification，HN-AD）成为研究热点。与其他生物脱氮工艺相比，HN-AD技术可以直接利用硝化产物作为反硝化底物，提高了脱氮反应效率；同时实现了在一个反应器内对COD和--12工业水处理2017-02，37（2）氨氮的同步去除，降低了污水处理厂建设运行成本。对于HN-AD技术的好氧反硝化过程，好氧反硝化菌（aerobicdenitrlfier）是最为关键的因素，它是利用好氧反硝化酶的作用，在有氧条件下进行反硝化作用的一类反硝化菌。20世纪80年代，L.A.Robertson等〔3〕报道了好氧反硝化细菌和好氧反硝化酶系的存在，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路。随后，人们陆续在土壤、沟渠、池塘、活性污泥、沉积物等中分离出能够在有氧条件下进行反硝化的好氧反硝化细菌。对于好氧反硝化菌的筛选及工艺应用一直以来受到广泛关注，对此笔者在综合国内外大量研究成果的基础上，对好氧反硝化菌的研究及应用进展进行了总结，并指出今后主要的研究方向。1好氧反硝化作用机制及酶系统1.1好氧反硝化作用机理目前，关于好氧反硝化的作用机制存在各种不同的观点，总结起来可以从微环境和生物学2种角度进行解释〔4〕。微环境理论主要侧重从物理学角度对作用机理进行解释〔5〕。该理论认为在微生物絮体内，由于氧的传递导致絮体内产生溶解氧浓度梯度，外部大环境氧的浓度较高，主要是好氧硝化菌进行硝化反应，絮体内部微环境氧的浓度较低，主要进行厌氧的反硝化反应。当生物反应池内溶解氧浓度不高时，会使缺氧环境的比例有所升高，会更有利于好氧反硝化作用的进行。另一方面，由于好氧反硝化菌和好氧反硝化酶系统的存在，可以从生物学角度对好氧反硝化作用进行阐释〔3〕。从生物学角度好氧反硝化作用包括4个还原步骤，分别由硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶、一氧化二氮还原酶〔6〕完成。L.P.Wilson等〔7〕在1993年提出了细菌在好氧反硝化过程中的电子传递模型（见图1），该模型显示，NO3-、O2均可作为电子的最终受体。反硝化菌可将电子从被还原的物质传递给O2，同时也可通过硝酸还原酶将电子传递给NO3-。1.2好氧反硝化酶系统1.2.1硝酸盐还原酶硝酸盐还原酶（nitratereductase，NaR），又称为周质硝酸盐还原酶（periplasmicnitratereduc⁃tase），其位于细胞质膜和细胞壁之间。L.C.Bell等〔8〕对T.pantotropha分别在有氧和厌氧条件下进行培养，结果表明，周质硝酸盐还原酶在好氧反硝化中能够优先表达，受氧分子的抑制性较小；与细胞膜相连接的膜结合硝酸盐还原酶，则在厌氧条件下优先表达，且仅在厌氧条件下发挥作用。D.J.Richardson等〔9〕的研究表明，碳源种类对周质硝酸盐还原酶活性影响较大，当碳源为丁酸盐、己酸盐时其活性最高，为醋酸盐时次之，当碳源为苹果酸盐和琥珀酸盐时活性最低。1.2.2亚硝酸盐还原酶亚硝酸盐还原酶（nitritereductase，NiR）在反硝化过程中主要有2种：一种是被人们熟知的血红素亚硝酸还原酶（细胞色素cd1），它位于细胞壁与细胞膜之间，在有氧和无氧条件下都能表达，它是一种双功能酶，能催化亚硝酸盐得到1个电子还原为NO，并使O2得到4个电子生成水〔10〕；另一种是铜型亚硝酸还原酶，位于外周胞质中，由nirk基因编码，在有氧和无氧条件下都能表达。1.2.3一氧化氮还原酶一氧化氮还原酶是一种膜结合的细胞色素bc型酶，由2个亚基组成，其大亚基呈疏水性，具有跨膜结构，能与b型血红素结合，小亚基可与c型血红素结合。一氧化氮还原酶已在施氏假单胞菌、脱氮副球菌等细菌中被分离提纯〔11〕，但是该酶很不稳定。一氧化氮还原酶对NO具有很高的亲和力，可使NO浓度维持在极低的水平。1.2.4一氧化二氮还原酶一氧化二氮还原酶位于膜外周质中，在低氧或缺氧条件下均能表达，作用产物为N2。它易受到低pH的抑制，对于氧的敏感性也高于其他脱氮酶。L.C.Bell等〔8〕认为，在氧气存在条件下，脱氮副球菌细胞中的一氧化二氮还原酶具有活性，能将NO、N2O2种气体同时还原。图1细菌反硝化过程的电子传递模式王永刚，等：好氧反硝化细菌研究及应用进展--13工业水处理2017-02，37（2）2好氧反硝化细菌的筛选研究2.1筛选分离方法好氧反硝化菌在环境中不是优势菌种，自然界存在较少，因此筛选分离具有一定困难。已经应用的成功的筛选分离方法有如下几种：（1）间歇好氧/厌氧富集法，又称间歇曝气法。该方法采用厌氧和好氧环境的频繁转换，使好氧反硝化菌成为优势菌种。L.A.Robertson等〔3〕根据脱氮副球菌在缺氧和好氧状态下都可以生长的特性，通过间歇曝气法筛选到好氧反硝化细菌脱氮副球菌。F.Lone等〔12〕在间歇厌氧/好氧运行的污水处理池的活性污泥中，分离出了16株反硝化细菌，它们在好氧和厌氧条件下都具有反硝化作用。（2）培养基选择法。该方法适用于对培养条件有特殊营养要求的好氧反硝化菌的定向筛选。J.B.M.Meiberg等〔13〕以三甲胺或二甲胺作为唯一碳源、氮源，在好氧条件下，以NO3-作为电子受体，分离得到菌株HyphomicrobiumX。（3）呼吸抑制剂法。利用呼吸抑制剂氰化钾（KCN）来筛选好氧反硝化细菌，即在反硝化培养基中加入KCN，同时对培养基曝气，KCN可终止呼吸链中电子向氧分子的传递，从而抑制能利用氧作为电子受体的呼吸反应〔14〕。另外，在筛选方法上还有滴加试剂法、极限稀释法以及综合筛选法等〔15-17〕，都在实际中得到了应用。2.2菌种来源国内外很多研究者发现并分离出了好氧反硝化菌，目前已经发现的好氧反硝化细菌约50多个属，130多个种，包括无色杆菌属（Achrombacter）、短杆菌属（Brevibacterium）、苍白杆菌属（Ochrobac⁃turum）等。其中，环境中最普遍存在的好氧反硝化细菌为假单胞菌属（Pseudomonaceae）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、副球菌属（Paracoccus）等。2.2.1污水处理设施许多研究表明，污水处理厂活性污泥中往往存在一定量的好氧反硝化菌，很多研究者也都从不同的污水处理工艺系统中分离筛选出多种具有好氧反硝化能力的菌株。C.S.Srinandan等〔18〕调查了4个不同污水处理厂污泥样品中反硝化细菌的种群结构，结果表明，丛毛单胞菌属（Comamonassp.）和假单胞菌（Pseu⁃domonassp.）具有高效的反硝化功能。王慧荣等〔19〕从城镇生活污水处理厂的活性污泥中，分离到1株好氧反硝化菌CW，鉴定为睾丸酮丛毛单胞菌（Co⁃mamonastestosteroni），具有高效硝酸盐氮去除效果。多数研究者从序批式活性污泥法SBR反应器中发现了好氧反硝化细菌。翟茜等〔20〕采用SBR反应器，通过间歇曝气方式对活性污泥进行强化驯化，共筛选得到4株好氧反硝化细菌，其TN去除率达到60%以上，并成功鉴定了其中3株，2株属于假单胞菌属（Pseudomonassp.）、1株属于代尔夫特菌（Delftiasp.）。李大鹏等〔21〕从SBR反应器中分离纯化得到1株好氧反硝化菌CFY1，鉴定为