好氧亚硝化颗粒污泥中硝化细菌群落结构分析1

第27卷第9期环境科学Vol.27,No.92006年9月ENVIRONMENTALSCIENCESep.,2006好氧亚硝化颗粒污泥中硝化细菌群落结构分析孙寓姣,左剑恶3,杨洋,鲁颐琼,邢薇,卜德华(清华大学环境科学与工程系,北京100084)摘要:在小试好氧上流式污泥床(AUSB)反应器中,实现了由厌氧颗粒污泥到好氧硝化污泥再到亚硝化颗粒污泥的转化,AUSB反应器的亚硝化率稳定在90%以上.利用FISH、荧光实时定量PCR等技术,考察了AUSB反应器中好氧颗粒污泥中硝化菌群的生态分布.结果表明:好氧亚硝化颗粒污泥呈层状结构,氨氧化细菌(AOB)主要分布在颗粒污泥表层,亚硝酸盐氧化细菌(NOB)多分布在内层,颗粒内核则无活性细胞;随反应器氨氮负荷逐渐提高,颗粒污泥中AOB的相对含量逐渐升高,当NH32N负荷分别为0、014、1、212kg/(m3·d),亚硝化率分别为0%、35%、50%、99%时,污泥中AOB在真细菌总量中所占比例分别为到0145%、5120%、15137%和48155%.关键词:亚硝化;好氧颗粒污泥;分子生态学;群落结构中图分类号:X70311文献标识码:A文章编号:025023301(2006)0921858204CommunityStructureofNitrificationBacteriainAerobicShort2CutNitrificationGranuleSUNYu2jiao,ZUOJian2e,YANGYang,LUYi2qiong,XINGWei,BUDe2hua(DepartmentofEnvironmentalScienceandEngineering,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China)Abstract:Byusingalab2scaleaeratedupflowsludgebedreactor,theinoculatedanaerobicgranulewascultivatedtoaerobicnitrificationgranule,andthenconvertedtoshort2cutnitrificationgranulewiththeshort2cutnitrificationefficienciesabove90%.Applingreal2timequantityPCR,andflorescentinsituhybridizationtechniques,theecologicalcommunitystructureofnitrificationbacteriainaerobicgranuleswerestudied.Theresultsshowthatthereexistedalayeredstructureintheaerobicgranule,theammoniaoxidizingbacteria(AOB)wasmainlylocatedinthesurfaceareaofthegranule,andthenitriteoxidizingbacteria(NOB)wasmainlylocatedintheinnerareaofthegranule,wasjustadjacenttotheAOB.Therewasnoactivebacteriaintheinnercorearea.TheamountofAOBinthegranulesincreased,astheammonialoadingrateofthereactorwasincreasedgradually.ThepercentageofAOBinthetotalamountofEubacteriainthegranulewas0145%,5120%,15137%,48155%respectively,astheammonialoadingrateofthereactorwere0,014,110and212kg/(m3·d)respectively,andthenitrosoficationefficiencywere0%,35%,50%,99%relatively.Keywords:short2cutnitrification;aerobicgranularsludge;molecularecology;communitystructure废水生物脱氮工艺可以有效将废水中的氮素污1材料与方法染物转化为氮气,最终达到去除废水中氮素污染物的目的,但传统的先硝化再反硝化的工艺流程很长,11颗粒污泥样品而且在硝化过程中还需要消耗大量的氧气和碱度,1试验中共采集了4个颗粒污泥样品,均取1个在反硝化过程中又需要加入足量的有机碳源,因此接种厌氧颗粒污泥与少量好氧硝化污泥的小试如何缩短生物脱氮途径、简化工艺流程以及降低运AUSB反应器.该反应器的总容积305L,其中反应行能耗是目前废水生物脱氮领域的研究热点.实现区16L,底部安装曝气装置,全无机含氨氮自配水11稳定高效的亚硝化工艺是缩短生物脱氮途径、简化从底部进入反应器,经污泥床进入沉淀区后排出,经工艺流程的关键第一步,也是众多新型生物脱氮工过长期运行,逐渐实现了稳定的亚硝化功能,并成功艺的关键步骤[1,2].本研究以厌氧产甲烷颗粒污泥地使接种的厌氧颗粒污泥转化为好氧硝化颗粒污和少量好氧硝化污泥接种启动1个好氧上流式污泥泥,并最终转化为好氧亚硝化颗粒污泥.床(AeratedUpflowSludgeBed,AUSB)反应器,实12仪器与试剂现了由厌氧颗粒污泥到硝化颗粒污泥,再到亚硝化()颗粒污泥的转化,亚硝化颗粒污泥反应器运行稳定;DNA提取试剂盒天为时代DP301;DNA纯1利用分子生物学技术对该反应器运行过程中4个不同阶段的颗粒污泥样品中的微生物种群结构进行了研究.收稿日期:2005209217;修订日期:2005210218基金项目:国家高技术研究发展计划(863)项目(2002AA601190)作者简介:孙寓姣(1975～),女,博士,主要研究方向为水污染控制中微生物生态学,E2mail:[e-mail]3通讯联系人,E2mail:[e-mail]9期环境科学1859化试剂盒(鼎国A014);杂交仪(ThermoHybaidBio后移入涂有Vectaboud的载玻片上,干燥后用TBA、rad);激光共聚焦显微镜(Olympus);Promega公司乙醇及二甲苯等进行脱蜡.pGEMTVectorSystemI;SYBRGreen荧光定量采用ROX(红色)标记的氨氧化细菌NSO190试剂盒(天为时代FP201);博日荧光定量PCR仪探针()5′CGATCCCCTGCTTTTCTCC3′和FITC(BioerFQD33A).(绿色)标记的亚硝酸盐氧化杆菌NIT3探针(5′13方法与步骤)[6]对颗粒污泥切片CCTGTGCTCCATGCTCCG3′131颗粒污泥基因组DNA的提取进行双重杂交[7],杂交温度46℃,甲酰胺浓度分别采用冻融破壁法提取颗粒污泥样品的总基因组为55%和40%,同时利用DAPI染色作为背景,最DNA,首先利用蛋白酶K水解,Tris饱和酚萃取与后在激光共聚焦显微镜上扫描成像.异丙醇沉淀分离[3],最后采用DNA纯化试剂盒进133荧光定量PCR(RTQPCR)行纯化.分别选用2对针对真细菌和氨氧化细菌的引132荧光原位杂交(FISH)物,经运行PCR确定各自的最佳运行条件和参数,采集污泥样品,立即用新配制的4%多聚甲醛如表1所示.以氨氧化细菌16SrDNA的189～654溶液固定,PBS缓冲液洗涤后,于PBS缓冲液和无序列片段的T质粒载体克隆[8]作为定量标准品,采水乙醇等体积混合液中在-20℃保存.利用石蜡包用TA粘末端克隆法制备重组质粒,并将其进行倍埋切片技术对颗粒污泥进行处理[4,5],首先将颗粒比稀释,稀释度分别为:106、107、108、109copies/mL.污泥固定,之后采用乙醇、水、叔丁醇混合物处理,再在荧光定量PCR检测中,利用标准品扩增得到定量用石蜡进行包埋后切片,切片厚度为8μm,展片之标准曲线,并结合标准曲线对样品进行定量分析.表1RTQPCR的引物及运行参数Table1PrimersandparametersofRTQPCR细菌种类引物名称序列运行条件P338f[9]预变性94℃3min,变性94℃10s,复性55℃真细菌5′ACTCCTACGGGAGGCAG3′P518r5′ATTACCGCGGCTGCTGG3′15s,延伸72℃30s,35个循环P189f[10]预变性94℃3min,变性94℃10s,复性57℃5′GGAGRAAAGCAGGGGATCG3′氨氧化细菌5′CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC3′20s,延伸72℃25s,35个循环P654r2结果与讨论中可以看出4次取样点相应的反应器工艺运行状况.21好氧亚硝化工艺的实现及颗粒污泥的获得22AOB与NOB在颗粒污泥中的空间分布AUSB反应器180d运行情况如图1所示.反应利用分别针对AOB以及NOB中硝化杆菌的器接种启动后,对进水中氨氮的去除率在前40d内NSO190和NIT3探针对4个污泥样品中的AOB和均较低Ò,仅为65%左右;在随后40d的运行中,氨氮NOB的空间分布进行原位观察,结果如图2所示.去除率明显提高,平均达到85%以上;但此时,反应从图2中可看出,在接种的厌氧颗粒污泥(样品A)器的亚硝化率(即出水中亚硝酸盐占总硝态氮的比中,2类细菌都几乎未能见到;而在样品B和C中,例)很低,说明该反应器此时主要完成的仍是全程硝则可同时发现AOB和NOB,AOB的数量要多于化.从运行第81d开始,通过对工艺运行条件的调NOB的,而且,AOB较明显地生长在颗粒表层,控,反应器逐渐向短程硝化转化,在第81～145d之NOB则生长在表层的下层,颗粒的中心部分则未发间,反应器的亚硝化率有较大提高,基本维持在现有微生物,可以推测此处应为接种的厌氧颗粒污95%;从第146d开始直到试验结束时,反应器的运泥的残余,即死亡的厌氧细菌.行效果良好,其氨氮负荷高达25kg/m3·d,氨氮去氨氮转化为硝酸盐的生物硝化过程是由AOB除率为95%以上,亚硝化率也高达99%.因此,在持和NOB共同完成的,AOB和NOB均是强烈好氧的续180d的运行中,AUSB反应器实现了稳定的亚硝自养型细菌,但AOB的氧化对象是原水中的氨氮,化功能,其运行结果如图1所示.在反应器的运行过而NOB的氧化对象则是AOB的产物亚硝酸盐[11].程中,分4次取得颗粒污泥样品A、B、C、D,从表2在颗粒污泥外侧的主体水流中,含有较高的溶解氧212211221122111111860环境科学27卷图1好氧上流式污泥床(AUSB)反应器的运行结果Fig.1Performanceofaeratedupflowsludgebedreactor表24次取样时反应器的运行状况Table2OperationalstatusofAUSBreactoratdifferentsamplingpoints样品名取样时间氨氮负荷氨氮去除率亚硝化率溶解氧/d/kg·(m3·d)-1/%/%/mg·L-1A1000613B25014783565C5010805066D1252292996511111和氨氮,为AOB的生长提供了良好条件,所以AOB倾向于生长在颗粒的表层;NOB虽然也需要较高浓度的溶解氧,但它同时还需要NO2-,因此,NOB通常生长在AOB的内层,如图2中b和c所示.在样品D中,可发现其中主要为AOB,NOB的数量很少,对比反应器此时的运行状况,可知,此时反应器的氨氮负荷已提高至212(kg/m3·d),氨氮去除率为92%,而亚硝化率已高达99%,而更重要的是,反应器从第90d开始实现了较高的亚硝化功能后,一直在较高的亚消化率下运行,至此,又已运行了30d,所以,颗粒污泥中的NOB在较长时间内