好氧异养硝化菌Acinetoba省略YY5的分离鉴定及脱氮机理金敏

应用与环境生物学报2009，15(5):692~697ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006-687X2009-10-25DOI:10.3724/SP.J.1145.2009.00692氮素是我国目前造成水体污染的主要原因之一，据国家环保总局2007年《中国环境状况公报》报道，我国主要湖泊氨氮污染较重，富营养化问题依然突出.因此，水体中氮素的去除，对于保护环境、发展经济和保障健康都具有重要的意义.目前，水处理中氮素的传统生物脱除主要是通过硝化和反硝化两个过程来完成，即氨氮由自养的硝化细菌在好氧条件下转化为硝态氮，然后再通过异养的反硝化细菌在缺氧条件下将硝态氮还原为氮气，排出水体.近几年来，随着厌氧氨氧化细菌、异养硝化细菌、好氧反硝化细菌等不同脱氮机理细菌的发现，生物脱氮研究的领域也不断拓宽[1~3]，但人们对这些新型微生物的了解还不够深入，对其生理特性、代谢途径以及处理工艺等方面的研究还比较缺乏.本文对好氧异养硝化细菌进行了筛选和鉴定，并从生理特性及分子生物学角度对其代谢机理和途径进行了研究.1材料与方法1.1培养基1.1.1异养硝化培养基(NH4)2SO40.5g，琥珀酸钠2.17g，维氏盐溶液50mL，加水溶解，补充蒸馏水至1000mL（若需固体培养基，则加入2%琼脂）.维氏盐溶液：K2HPO45.0g，MgSO4·7H2O2.5g，NaCl2.5g，FeSO4·7H2O0.05g，MnSO4·4H2O0.05g，溶解后加水定容至1000mL.1.1.2亚硝酸盐培养基将异养硝化培养基的氮源换成好氧异养硝化菌Acinetobactersp.YY-5的分离鉴定及脱氮机理*金敏王景峰孔庆鑫赵祖国王新为谌志强陈照立邱志刚李君文**（军事医学科学院卫生学环境医学研究所环境卫生研究室天津300050）IsolationandDenitrificationMechanismofanAerobicHeterotrophicBacteriumAcinetobactersp.YY-5*JINMin,WANGJingfeng,KONGQingxin,ZHAOZuguo,WANGXinwei,SHENZhiqiang,CHENZhaoli,QIUZhigang&LIJunwen**(InstituteofHygieneandEnvironmentalMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Tianjin300050,China)AbstractAnaerobicheterotrophicbacteriumYY-5,whichcoulddegradeNH4+-Nfrom95.23mg/Lto1.29mg/Lin3days,wasstudiedtorevealitsdenitrificationmethanismatthelevelofproductcharacteristicsandseveraldenitrificationenzymesencodinggenes.TheresultsdemonstratedthebacteriaproducedlargequantitiesofCO2andN2,butsmallnitriteandnitrateaccumulations.Furthermore,strainYY-5hadammoniamonooxygenaseencodinggene(amoA)whichencodestheenzymetooxidizeammoniatohydroxylamine.Also,thestrainhadanewhydroxylamineoxidoreductaseencodinggene(hao)whosesequencewasdistinctnotonlytothatofautotrophicbacteriabutalsotothatofheterotrophicbacteria.ItsnapAgenewasalsogreatdifferentwiththereportedgenesfromtheknownaerobicheterotrophicbacteriabyBlastcomparison.ThestrainwasidentifiedasAcinetobactersp.YY-5accordingtoitsmorphological,physiologicalandbiochemicalcharacters,aswellas16SrDNAsequencehomologycomparison.Fig6,Tab3,Ref15Keywordsaerobicheterotrophicbacterium;Acinetobactersp.YY-5;methanism;denitrificationCLCX172摘要通过异养硝化培养基获得一株高效脱氮细菌，并通过形态学特征、生理生化反应及16SrDNA同源性比较对筛得菌株进行了鉴定；分别以NO3--N和NO2--N为唯一氮源，通过对脱氮过程中各种含氮代谢物的定量及对脱氮相关基因氨单加氧酶基因（amoA）、羟胺氧化酶基因（hao）、周质硝酸盐还原酶亚基基因（napA）的扩增及测序比较，对该菌株的生理途径及脱氮机理进行了研究.结果表明，高效脱氮细菌YY-5不能发生好氧反硝化，但能在3d内将氨氮由95.23mg/L降解至1.29mg/L，降解率达到98.6%，同时未发现亚硝酸盐氮、硝酸盐氮积累；对该菌主要代谢气体产物进行检测，发现CO2和N2明显增多，无N2O生成；经鉴定，初步判定该菌为不动杆菌属，命名为Acinetobactersp.YY-5；从该菌基因组中均能扩增出amoA、hao、napA等基因，其中napA与hao基因与已报道的napA与hao基因进行Blast比较，发现具有较大差别.图6表3参15关键词好氧异养硝化菌；Acinetobactersp.YY-5；机理；脱氮CLCX172收稿日期：2008-09-05接受日期：2008-12-05∗国家自然科学基金项目（No.30600487），国家“863”项目（No.2006AA06Z334）和天津市应用基础研究计划项目（No.07JCYBJC07000）资助SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30600487),theNationalHigh-techResearchandDevelopmentProgramofChina(No.2006AA06Z334)andtheAppliedBasicResearchProgramofTianjin,China(No.07JCYBJC07000)∗∗通讯作者Correspondingauthor(E-mail:[e-mail])6935期金敏等：好氧异养硝化菌Acinetobactersp.YY-5的分离鉴定及脱氮机理KNO2，其它同异养硝化培养基.1.1.3硝酸盐培养基将异养硝化培养基的氮源换成KNO3，其它同异养硝化培养基.1.2好氧异养硝化菌的筛选1.2.1　采样与富集　　样品采自天津西青开发区、纪庄子污水处理厂、丰华肥料厂等地.利用异养硝化培养基曝气培养富集2~3wk，其间适时补充新鲜培养基.1.2.2细菌的初筛与复筛从样品富集液中吸取1mL培养液，加入新鲜液体异养硝化培养基中30℃、120r/min摇床培养3d.检测氨氮量，将氨氮降低的样品重复以上操作两次.然后将氨氮降低较明显的样品稀释107倍，将稀释液移入新鲜培养基中，30℃、120r/min摇床培养3d.检测氨氮降低量，选取氨氮降低最多的样品划线接种在异养硝化固体培养基表面，30℃培养3d，挑取单菌落，作为初筛菌.将初筛菌接种于新鲜液体培养基中，30℃、120r/min摇床培养3d，进行复筛.将氨氮降低最明显的菌落划线接种在异养硝化固体培养基表面，挑单菌落纯化两次，即得到所筛选菌株.1.2.3菌株脱氮活性的测定[3~5]硝酸盐测定：酚二磺酸紫外分光光度法；亚硝酸盐测定：N-(1-萘基)-乙二胺光度法；氨氮的测定：纳氏试剂光度法；总氮的测定：过硫酸钾氧化–紫外分光光度法；CO2、N2及O2定量测定：GC/TCD检测；N2O定量测定：利用GC/ECD检测.1.3菌株的鉴定1.3.1　形态学鉴定将菌株进行革兰染色和芽孢染色，然后光镜观察菌体形态；同时，将菌体进行JEOL-JSM25S扫描电子显微镜观察并摄像.1.3.2　生理生化鉴定依据《伯杰细菌分类手册》进行鉴定.1.3.3VITEK微生物分析仪鉴定由天津医科大学附属医院鉴定.1.3.4　16SrDNA同源性比较利用DNA提取试剂盒提取细菌模板，PCR反应引物见表1.反应体系的组成为：DNA模板2μL；dNTP混合物4μL；TaqDNA聚合酶1μL；引物各1μL；TaqDNA聚合酶的10×反应缓冲液5μL；加双蒸水至终体积为50μL.PCR反应条件[6]：94℃预变性10min；94℃，1min；52℃，1min；72℃，3min，进行30个循环；最后72℃延伸7min.PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，选择目的DNA片段并切下，采用上海生工生物技术服务有限公司柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收.测序由大连宝生物公司完成，测序结果提交GenBank进行blast分析.1.3.5氨单加氧酶基因（amoA）的扩增参照文献[7]，同时选取引物AMO1F/AMO2R作为内部引物进行套式PCR，引物扩增的区间及扩增片段的长度见表1.菌株煮沸裂解法提取模板，反应体系为：10×反应缓冲液5µL，dNTP（2.5mmol/L）4µL，上游引物（10µmol/L）1µL，下游引物（10µmol/L）1µL，模板2µL，Taq酶（2.5U/µL）1.25µL，水35.75µL.PCR反应条件：94℃变性5min；然后进行30个循环：94℃，40s；40℃，40s；72℃，40s；最后72℃延伸7min.PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳并纯化回收后，测序由大连宝生物公司完成，测序结果提交GenBank进行blast分析.1.3.6羟胺氧化酶（hao）基因的扩增根据已报道的hao基因序列，进行同源性比较，利用Oligo6.0进行引物设计，选择在保守区的引物对HAO1/HAO2，同时选取引物HAOI1/HAOI2作为内部引物进行套式PCR（表1）.菌株煮沸裂解法提取模板，PCR反应体系为：10×反应缓冲液5µL，dNTP4µL，上游引物HAO1（50µmol/L）1µL，下游引物HAO2（50µmol/L）1µL，模板2µL，Taq酶（2.5U/µL）1µL，水35µL；PCR反应条件：94℃变性5min；然后进行30个循环：94℃，30s；52℃，30s；72℃，60s；最后72℃延伸7min.将该PCR产物为模板进行套式PCR，反应体系组成为：10×反应缓冲液5µl，dNTP（2.5mmol/L）4µL，HAOI1（50µmol/L）1µL，HAOI2（50µmol/L）1µL，PCR产物0.5µL，Taq酶（2.5U/µL）1.25µL，水37.25µL；PCR反应条件：94℃变性5min；然后进行20个循环：94℃，20s，40（42，45，47，50，52）℃，20s，72℃20s；最后72℃延伸7min.测定纯化后的HAO1/HAO2扩增产物序列，由大连宝生物公司完成，测序结果提交GenBank进行Blast分析.1.3.7周质硝酸盐还原酶亚基基因（napA）的扩增参照文献[8].PCR扩增引物见表1.反应体系为：DNA模板，1μL；dNTP混合物，4μL；TaqDNA聚合酶，1μL；引物各2μL；TaqDNA聚合酶的10×反应缓冲液5μL；加双蒸水至终体积为表1实验所用引物Table1Primersusedinthisstudy扩增目的基因Tagetgeneforamplification引物Prime