荷花ISSR引物筛选及反应体系优化徐君

．ISSＲJ．2014421042－44．ISSＲ徐君，李静会，李欣，姜红卫215155UBC100ISSＲ2DNAPCＲ。ISSＲ－PCＲ5Mg2+、、dNTP、DNA、TaqISSＲ25μL10×TaqBuffer2．5μLMg2+3．0mmol/LdNTP0．2mmol/L1．0μmol/LTaq1．00UDNA40ng。8ISSＲPCＲ61ISSＲ。ISSＲS682．320．1A1002－1302201410－0042－032013－12－09CX125075。1982—。[e-mail]。。[e-mail]。Nelumbonucifera、、、1。。800。《》、、、3616482。、、3。、。ISSＲ、、DNA、、ＲFLP、ＲAPDISSＲ、4－6。ISSＲ、、7－10。ISSＲAT、CG11。、、ISSＲ。2010、、。。ISSＲISSＲ、、ISSＲISSＲ。11．1材料、2。DNAMarker、PCＲ。100ISSＲ。1．2方法1．2．1DNA20136—70．5cm、13－70℃。CTAB12－13DNA。1%DNA260、280nmDNA、－20℃PCＲDNA100ng/μL。1．2．2ISSＲ807DNAISSＲ。94℃5min94℃30s58℃45s72℃1min3572℃10min4℃。25μL10×TaqBuffer2．5μLMg2+1．5、2．0、2．5、3．0、3．5mmol/LdNTP0.1、0.2、0．3、0．4、0．5mmol/L0.2、0.4、0.6、0．8、1．0μmol/LTaq0．25、0.50、0.75、1.00、1．25UDNA20、40、60、80、100ng。1%UV。1．2．3ISSＲPCＲ100ISSＲ8PCＲ“1．2．2”。PCＲ94℃5min94℃30s50～60℃2℃/645s72℃1min3572℃10min4℃。“1．2．2”。—24—2014421022．1基因组DNA提取与检测DNACTABDNADNA1。2．2各因素水平对ISSＲ扩增反应的影响、Mg2+、dNTP、Primer、Taq、DNAISSＲ2。2．2．1Mg2+ISSＲ－PCＲ2－aMg2+1．5mmol/LMg2+dNTP、、。Mg2+3．5mmol/LMg2+1．5～3．5mmol/LISSＲMg2+3．0mmol/L。2．2．2dNTPISSＲ－PCＲdNTP。2－bdNTP0．1mmol/LdNTP0．2mmol/L2。dNTP0．1mmol/L。2．2．3ISSＲ－PCＲ2－cPCＲ。1．0μmol/L。2．2．4DNAISSＲ－PCＲ2－dDNAISSＲ－PCＲDNA100ngDNA25μL40ngDNA。2．2．5TaqISSＲ－PCＲ2－eTaq1．0U1．25UTaq25μL1UTaqDNA。2．2．6ISSＲISSＲ25μL1。1ISSＲ/μL10×Taq1×2．525mmol/LMg2+3．0mmol/L3．02mmol/LdNTP0．2mmol/L2．525μmol/LPrimer1．0μmol/L1．05U/μLTaq1．00U0．225ng/μLDNA40ng1．0ddH2O14．82．3荷花ISSＲ引物筛选及退火温度对各引物扩增的影响2．3．1ISSＲ、—34—201442102DNAUBC100“2．2”PCＲ37。28ISSＲ2。2．3．2ISSＲ8ISSＲ6。、Tm。28613。28ISSＲ5'→3'℃ISSＲ807AG8T585808AG8C589836AG8YA6010840AG8YT608842GA8YG6011845CT8ＲG585846CA8ＲT586848CA8ＲG5873ISSＲISSＲＲAPD、ＲFLP、PCＲ14－15。PCＲTaq、Mg2+、、dNTP、DNA。ISSＲISSＲ25μL10×TaqBuffer2．5μLMg2+3．0mmol/LdNTP0．2mmol/L1．0μmol/LTaq1．0UDNA40ng。UBC1008、。ISSＲ。、ISSＲPCＲISSＲDNA。8ISSＲ807、808、836、840、842、845、846、848PCＲ、61ISSＲISSＲ。ISSＲ－PCＲ、、。1．M．19871－3．2．M．20057－9．3HanYCTengCZChangFetal．AnalysesofgeneticrelationshipsinNelumbonuciferausingnuclearribosomalITSsequencedataISSＲandＲAPDmarkersJ．AquaticBotany2007872141－146．4ZietkiewiczEＲafalskiALabudaD．GenomefingerprintingbysimplesequencerepeatSSＲ－anchoredpolymerasechainreactionamplificationJ．Genomics1994202176－183．5．DNAJ．200719433－3639．6VosPHogersＲBleekerMetal．AFLPanewtechniqueforDNAfinger－printingJ．NuclAcideＲes199523214407－4414．7．ISSＲJ．20084116－119．8．ISSＲD．2007．9．ISSＲJ．2005226626－629．10．IS-SＲJ．20103071331－1336．11．ISSＲ－PCＲJ．200954284－288．12．ISSＲJ．200421154－58．13DolyeJJDolyeJL．ArapidDNAisolationprocedureforsmallquan-titiesoffreshleaftissueJ．PhytochemBul19879111－15．14．ISSＲ－PCＲJ．201341236－38．15．ISSＲPCＲJ．2012135870－878．—44—20144210