荷花NnNHX1基因耐盐性在转化烟草中的验证郭会敏

园艺学报2012，39（2）：323–[e-mail]收稿日期：2011–10–08；修回日期：2012–01–03基金项目：上海农业科学技术成果及高新技术产业化项目（沪农科产字[2004]第3号）*通信作者Authorforcorrespondence（E-mail：[e-mail]）荷花NnNHX1基因耐盐性在转化烟草中的验证郭会敏，顾春笋，陈发棣，徐迎春，刘兆磊*（南京农业大学园艺学院，南京210095）摘要：为研究荷花液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因NnNHX1的耐盐性，构建了植物表达载体pCAMBIA1301-220-NnNHX1，并通过农杆菌介导的叶盘转化法将NnNHX1基因转入烟草。利用荧光定量PCR分析NnNHX1在转基因烟草中的表达情况。对转基因烟草进行盐胁迫试验，并测定其在盐胁迫条件下叶绿素、脯氨酸和丙二醛含量、相对电导率、SOD和POD活性等相关生理指标及后代种子的发芽率。结果显示，在获得的7个转NnNHX1基因烟草株系中，T-N1、T-N2和T-N10等3个株系NnNHX1表达量较高。盐胁迫下，转基因烟草组培苗和盆栽苗的生长状况都好于对照植株，在叶绿素含量、脯氨酸含量、细胞质膜的完整性（相对电导率和丙二醛含量）和抗氧化酶（SOD和POD）活性等方面都好于对照，并且后代种子的发芽率也明显高于对照。表明荷花NnNHX1基因能够在烟草中正常翻译和表达，NnNHX1的过量表达提高了转基因烟草的耐盐性。关键词：荷花；NnNHX1基因；转基因；烟草；耐盐性中图分类号：S682.32文献标识码：A文章编号：0513-353X（2012）02-0323-10SaltToleranceVerificationofLotusNnNHX1inTransformedTobaccoGUOHui-min，GUChun-sun，CHENFa-di，XUYing-chun，andLIUZhao-lei*（CollegeofHorticulture，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China）Abstract：TostudythesalttoleranceoftobaccoplantstransformedwithlotusvacuolarNa+/H+antiportergeneNnNHX1，aplantexpressionvectorpCAMBIA1301-220-NnNHX1wasconstructedandthenwastransformedintowildNicotianatabacumbyAgrobacterium-mediatedleafdisctransformation.TheexpressionofNnNHX1intransgenictobaccowasdetectedbyquantitativePCRanalysis.Saltstresstestontransgenictobaccoandthenthechlorophyll，prolineandMDAcontent，relativeconductivity，SOD，PODandotherphysiologicalindexesandthegenerationrateoftransgenictobaccoseedweremeasuredinsaltstresscondition.Theresultsshowedthatamongtheseventransgenictobaccostrains，theexpressionofNnNHX1inT-N1，T-N2andT-N10strainswashigher.Undersaltstress，thegrowthconditionsofbothtissuecultureseedlingsandpottedseedlingsoftransgenictobaccowerebetterthancontroltobacco.Thechlorophyllandprolinecontentandcellmembraneintegrity（relativeconductivityandMDA）andantioxidantenzyme（SODandPOD）activityintransgenictobaccowerebetterthanthatofcontroltobacco，andthetransgenictobaccoseedgerminationwassignificantlyhigherthancontrol.IndicatedthatlotusNnNHX1genecouldnormalytranslatedandexpressedintobacco，andoverexpressionofNnNHX1324园艺学报39卷enhancedsalttoleranceoftransgenictobacco.Keywords：lotus；NnNHX1gene；transgenic；tobacco；salttolerance盐胁迫严重扰乱植物细胞内的离子平衡，致使细胞膜功能受损和代谢活动减弱（Niuetal.，1995；Hasegawaetal.，2000；Xiong&Zhu，2002）。植物经过长期的适应和进化逐渐形成了一系列的调节机制应付外界的盐胁迫（Zhangetal.，2008），如通过Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1调控将过多的Na+区隔化于液泡中（Blumwaldetal.，2000；周玲玲等，2009）。因此，对NHX1基因的耐盐特性进行深入的研究有着重要的意义。Apse等（1999）在拟南芥中过量表达拟南芥AtNHX1基因可以使转基因植株在200mmol·L-1NaCl的胁迫下正常生长；Zhang等（2001）在油菜中转入AtNHX1基因，发现其不但可以在高盐环境中正常生长，开花，结果，且产量和品质不受影响；将耐盐植物北滨藜的AgNHX1基因转入水稻经过量表达其耐盐性是对照植株的8倍（Ohtaetal.，2002）；在烟草中过量表达油菜BnNHX1基因（Wangetal.，2004）、大麦HbNHX1基因（Lüetal.，2005）和獐茅AlNHX1基因（张高华等，2008）等都可以显著提高转基因植株的耐盐性。荷花（NelumbonuciferaGaertn.）为水生观赏植物，多生长于淡水湖泊区，耐盐性较差，但生长于温带沿海地带的‘冬荷’却有较强的耐盐性，并且可以在一定程度上淡化海水（王其超和张行言，2005）。目前对‘冬荷’的研究较少，尤其是耐盐特性更是缺乏研究。本研究中构建‘冬荷’NnNHX1基因的植物表达载体，并通过农杆菌介导的叶盘转化法获得转NnNHX1基因烟草植株，根据盐胁迫下转基因烟草的表型变化、叶绿素、脯氨酸和丙二醛的含量、相对电导率、SOD和POD的活性以及后代种子的发芽率等对转基因烟草的耐盐性进行分析，为进一步研究NnNHX1基因功能提供依据。1材料与方法1.1材料本试验于2009年6月至2011年5月在南京农业大学花卉遗传与育种实验室完成。供试荷花品种‘冬荷’（NelumbonuciferaGaertn.‘Donghe’）取自南京艺莲苑花卉有限公司，烟草无菌苗由本实验室保存。植物双元表达载体pCAMBIA1301-220由南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室惠赠并经本实验室改造，农杆菌EHA105感受态为本实验室制备并保存。1.2植物表达载体的构建提取‘冬荷’总RNA并经反转录合成cDNA，根据NnNHX1基因（登录号：AB501188）序列设计ORF引物EF-F和EF-R（分别含有限制性内切酶SalⅠ和KpnⅠ的酶切位点），经PCR扩增后得到NnNHX1基因的ORF片段，将目的片段连接T载体并提取质粒。分别对T-NnNHX1质粒和植物表达载体pCAMBIA1301-220质粒用SalⅠ和KpnⅠ进行双酶切，回收目的片段并用T4连接酶进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并经LB/Kan培养基筛选、检测后获得pCAMBIA1301-220-NnNHX1表达载体。1.3农杆菌介导的烟草转化将经过预培养3d的烟草无菌苗叶片于农杆菌EHA105菌液中浸泡5~8min，取出并吸去多余菌液后接种于共培养培养基（MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，pH5.8），25℃培养2~3d；然后转入筛选培养基（MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+Hyg30mg·L-1+Cb500mg·L-1，2期郭会敏等：荷花NnNHX1基因耐盐性在转化烟草中的验证325图1荷花NnNHX1基因ORF片段PCR结果M：DNAladdermarker；1：目的片段。Fig.1ThePCRamplificationofNnNHX1geneM：DNAladdermarker；1：PCRproduct.pH5.8），于25℃下光照培养，1个月后继代培养1次，直至分化出抗性芽；待抗性芽长至3~5cm时，剪下并转入生根培养基（1/2MS+IBA0.1mg·L-1+Hyg30mg·L-1+Cb200mg·L-1，pH5.8）中诱导生根。1.4转基因烟草的鉴定选取正常绿色的烟草抗性植株分别提取基因组DNA和总RNA，并将总RNA经反转录合成cDNA。分别以基因组DNA和cDNA为模板，以潮霉素特异引物Hyg-F、Hyg-R和NnNHX1基因特异引物EF-F、EF-R进行PCR检测。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；然后72℃延伸10min。1.5NnNHX1在转基因烟草中的表达分别提取转基因株系和对照株系烟草的总RNA并反转录后合成cDNA。以烟草肌动蛋白基因actin的引物Actin-F、Actin-R为内参引物，以NnNHX1基因的非保守区引物qRT-F1、qRT-R1及保守区引物qRT-F2、qRT-R2为特异引物进行qRT-PCR。反应程序为：95℃1min；95℃15s、60℃15s、72℃45s，40个循环；然后72℃10min。设定一阈值并得到各个反应的CT值，根据2-ΔΔCT法（Livak&Schmittgen，2001）得出转基因烟草中NnNHX1基因与总NHX1基因的相对表达量。表1试验中用到的引物Table1Primersusedinthisexperiment名称Name序列（5′→3′）Sequence名称Name序列（5′→3′）SequenceEF-FACGCGTCGACATGGCTTTAGGTTCTGTTEF-RCGGGGTACCCCATGGATGTACACTCCGHyg-FCGTCTGTCGAGAAGTTTCHyg-RTACTTCTACACAGCCATCactin-FGTGACAATGGAACTGGAATGGactin-RAGACGGAGGATAGCGTGAGGqRT-F1TGCTGCTGCTCTCTCTCTCTqRT-R1CGAACCCAAATTCGAATCAAqRT-F2GGGAGTGGTTACTGGTCTGCqRT-R2ATGACAATGTCGCAAAAGCA1.6转基因烟草耐盐性分析将株高约为2cm的转基因烟草组培苗与对照苗分别转至NaCl浓度为0、100和200mmol·L-1的MS培养基上培养3周，进行耐盐性观察。另将转基因株系和对照烟草组培苗移栽于温室基质中自然生长1个月，然后分别用含0、100和200mmol·L-1NaCl的营养液进行盐胁迫处理7d，观察其表型变化（每处理设3次重复，每重复3株苗），并测定叶片中叶绿素、脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）含量、相对电导率（REC）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性等生理指标。收