红树林根际解磷菌分离培养及解磷能力的研究

红树林根际解磷菌分离、培养及解磷能力的研究摘要:本实验从红树林根际分离出不同种类的解磷细菌,经过筛选获得一株解磷能力较强的菌株ZB0211,在纯培养的条件下,对这株解磷菌进行最适培养条件试验。结果表明:碳源以10g#kg-1的蔗糖最佳,氮源以1g#kg-1NH4Cl最好,10g#kg-1NaCl浓度为最适生长浓度,最适初始pH值为715。同时进行的解磷能力实验也表明pH值、菌数与解磷能力这三者之间存在一定的相关性。关键词:红树林;解磷细菌;分离;培养条件;解磷强度磷是植物生长发育所必需的重要营养元素之一,但是土壤中的磷绝大部分呈有机或无机磷化物状态,植物不能直接吸收,解磷菌能将植物难以吸收利用的磷转化为植物可吸收利用的磷[1],因此,利用微生物的解磷作用弥补土壤磷素营养的不足,成为当前国内外非常关注的研究课题。本研究试图利用微生物改善红树林土壤中磷素缺乏问题。红树林是生长在热带亚热带海岸潮间带,受到海水周期性浸淹的木本植物群落。由于间隙水富含阳离子,磷酸盐通常沉淀在底泥中,致使大量的磷元素不能被红树林直接利用[2],影响红树林的生长,所以提高磷素利用率对促进红树植物生长有重要意义。本研究从红树林根际分离不同种类的解磷菌,并进行培养条件及解磷能力的研究,为红树林人工接种解磷菌提供优良菌株与培养技术。1材料与方法111红树林根际解磷菌株的分离从湛江高桥红树林保护区内采集红树植物根系,主要包括白骨壤(Avicenniamarina(Forsk1)Vierh1)、无瓣海桑(SonneratiaapertalaBuch1-Ham)和木榄(Bruguieragymnorrhiza(L1)Lamk),用无菌胶袋装好带回实验室。在实验室内把附着在根表面的土抖掉,在流水下轻轻冲洗干净后,再用无菌水冲洗5~8次,用消毒灭菌过的解剖刀切成015~110cm的根段,分别置于装有50mL改良SRSM培养液的三角瓶中,在28~30e摇床培养5d(190r#min-1)。随后取样稀释涂平板,挑取典型菌落进一步纯化培养[3]。112解磷菌的培养培养基采用改良的SRSM无机磷培养基[4]。采用液体振荡培养法(190r#min-1),培养温度为28~30e,培养时间3~5d。113解磷菌数量测定方法采用比浊法。将培养好的菌液在721型分光光度计上比色,以600nm的光密度值(OD值)作为解磷菌密度指标。114解磷能力的测定11411液体解磷能力测定将不加磷源的改良SRSM液体培养基100mL分装在250mL三角瓶中,1@105Pa,30min灭菌,接种前精确加1g灭菌Ca3(PO4)2粉,接种量4%,29~31e,190r#min-1摇床培养36h,9500r#min-1离心5min,上清液用磷钼兰比色法[5]测定水溶性磷含量,以水溶性磷含量占Ca3(PO4)2粉全磷含量的百分比作为磷细菌的磷素转化率。每株菌3次重复。11412固体解磷能力测定将筛选出的解磷能力较强的菌株,摇床培养24h后的菌液适当稀释后分别涂在装有15mL固体SRSM培养基的平板上,30e恒温培养72h,观测解磷透明圈大小。11413pH值、菌数以及解磷能力动态测定每隔6h取样测定培养液的pH值、菌数和水溶性磷含量。磷素转化率的测定方法同上,pH值用pHS-3C型酸度计直接测定,菌数的测定采用稀释平板法。115培养条件的研究基础培养基用111g#kg-1K2HPO4可溶性磷源替换改良SRSM培养基的原有磷源。以下试验每组处理均进行3次重复。11511碳源试验去掉基础培养基中原有的碳源,分别添加10g#kg-1的葡萄糖、蔗糖、淀粉3种试验碳源。11512氮源试验去掉基础培养基中原有的氮源,分别添加1g#kg-1的NH4Cl、(NH4)2SO4、酵母提取物以及酪蛋白水解物。11513pH值试验采用基础培养基,灭菌前将pH值调至510、610、615、710、715、810。11514NaCl试验基础培养基中的NaCl浓度分别为5、10、15、20、25、30g#kg-1。2结果与分析211解磷菌分离结果表1对分离菌株(10株)及引进的墨西哥红树林菌株(3株)的材料来源地、宿主植物和菌落特征进行了描述。分离菌株来自三种宿主植物,菌落大都呈圆形或近圆形,表面光滑,质地松软,其中ZB0211、ZB0212、ZB0204和ZW0405生长快,筛选优良菌株时可优先考虑。212解磷能力的比较13株解磷菌的解磷能力见表2。从表2看出,供试菌株对磷的平均转化率为0106%~8101%,方差分析表明不同菌株的转化率之间差异显著,经LSR分析可知其中菌株ZB0211的解磷能力最强,其转换率为8101%,ZM0609菌株的解磷能力最弱,其转化率为0106%。比较后,初步筛选出解磷能力强的优良菌株ZB0211。90林业科学研究第17卷表1分离菌株及菌落特征菌株号材料来源地宿主植物菌落特征(培养4d)ZB0211湛江高桥镇红树林保护区白骨壤圆形中凹隆起状,表面光滑,杏黄色ZB0212湛江高桥镇红树林保护区白骨壤近圆形隆起状,表面光滑,褐色ZB0204湛江高桥镇红树林保护区白骨壤椭圆形稍凸起,表面光滑,象牙黄色ZB0205湛江高桥镇红树林保护区白骨壤圆形稍凸起,表面光滑,谷黄色ZB0306湛江高桥镇红树林保护区白骨壤圆形稍凸起,表面粗糙,乳白色ZB0307湛江高桥镇红树林保护区白骨壤近圆形稍隆起,表面光滑,褐色ZB0409湛江高桥镇红树林保护区白骨壤圆形突起状,表面光滑,苹果红色ZW0405湛江高桥镇红树林保护区无瓣海桑圆形中凹隆起状,表面光滑,酪黄色ZW0507湛江高桥镇红树林保护区无瓣海桑近圆形稍凸起,表面光滑,乳白色ZM0609湛江高桥镇红树林保护区木榄圆形稍凸起,表面粗糙,鸭舌黄色B1atr墨西哥西北生物中心白骨壤假根状,表面粗糙,荔肉白色B1amy墨西哥西北生物中心白红树不规则状,表面光滑,荔肉白色B1lic墨西哥西北生物中心白红树不规则状,边缘不整齐,褚红色表2发酵液磷素转化率菌株含磷量/(mg#L-1)转化率/%菌株含磷量/(mg#L-1)转化率/%ZB02111601118101aB1amy421382112fZB02121531027166bZB0205371741189gZB02041521557163bZB0307281421142hZB04091071135136cZW0405251021125iB1atr961324182dZW050721540113jB1lic811734108eZM060911100106kZB0306421602113f注:转化率后英文字母不同者表明经LSR分析差异显著(P=0105)。图1不同碳源、不同氮源对ZB0211菌量的影响另外通过平板测定透明圈的方法进行解磷菌解磷能力的比较,这是一种简单而方便的定性测定磷细菌的方法。磷细菌在生长过程中分泌一些物质,并向周围扩散,使菌落周围培养基中磷酸盐溶解而呈现透明状。结果表明:ZB0211菌株的菌落和透明圈平均直径分别为310~412、610~810mm,透明圈与菌落直径之比为210~216;B1atr菌株的菌落和透明圈平均直径分别为410~510、910~10mm,透明圈与菌落直径之比为2125~2100;ZM0609菌株的菌落直径为011~012mm,透明圈和菌落大小接近,其它菌株的菌落和透明圈直径之比为1~3,该实验结果再次证实,ZB0211菌株的解磷能力较强。213解磷菌的最适培养条件21311最适碳源碳是构成微生物细胞和代谢产物中碳架来源的重要营养物质,故碳源的选择对微生物培养至关重要。本试验比较了葡萄糖、蔗糖、淀粉3种常见碳源对解磷菌ZB0211生长的影响,经方差分析可知,不同的碳源对解磷菌的生长影响显著(表3)。从图1中可看出,解磷菌ZB0211在碳源为蔗糖的培养基中生长最好,其OD值为11566,在淀粉为碳源的培养基中生长较差,其OD值为01496。91第1期万璐等:红树林根际解磷菌分离、培养及解磷能力的研究21312最适氮源解磷菌在氮源为NH4Cl、(NH4)2SO4、酵母提取物以及酪蛋白水解物的培养基中的生长情况见图1,4种氮源对菌体生长的影响显著(表4)。从图1中可以看出,解磷菌在无机氮源培养基中生长较好,其中在NH4Cl为氮源的培养基中生长最好,OD值为112;在有机氮源的培养基中生长较差,其中以酪蛋白水解物为氮源的培养基中生长最差。表3不同碳源影响菌量的方差分析变异来源平方和自由度方差FC源210169211008464501601**重复0100096010016总和2101788表4不同氮源对菌量的方差分析变异来源平方和自由度方差FN源0147583011586441335**重复0102868010036总和0150441121313最适NaCl浓度由于该解磷菌的宿主植物白骨壤生长在海边沙滩上,生境的特点决定菌株的特性,故试验对培养基中的NaCl浓度进行调试,分别设置6种浓度,菌体生长结果见图2。6种NaCl浓度对菌体影响差异极显著(表5)。从图2中可以看出,当NaCl浓度为10g#kg-1时,解磷菌生长最好,其菌体密度最大;随着NaCl浓度增加,菌体密度反而下降。21314最适初始pH值不同初始pH值条件下对解磷菌ZB0211的菌体生长影响的结果见图3,方差分析结果显示,初始pH值对菌体影响差异极显著(表6)。从图3可以看出,pH值为715时最适合解磷菌的生长,pH值810次之,故该解磷菌最适pH值较一般细菌高。图3不同初始pH值对菌量的影响图2不同NaCl浓度对菌量的影响表5不同NaCl浓度影响菌量的方差分析变异来源平方和自由度方差FNaCl01545350110917127**重复01181201015总和01725317表6不同初始pH值影响菌量的方差分析变异来源平方和自由度方差FpH1129155012583311953**重复0109712010081总和11388517214pH值、菌体数量与解磷能力pH值、菌体数量与解磷能力三者之间的动态变化见图4、5。从图4、5看出,B1atr和ZB0211菌株的菌体数量和磷的转化率变化趋势基本一致,菌体数量增多其转化率也增高;但与pH值的变化正好相反,pH值较高时其转化率较低,即酸度降低时其解磷能力提高。普遍认为,解磷菌对难溶无机磷酸盐的解磷机理是菌体生长过程中产生各种有机酸而将其中的磷溶解释放出来,即/酸解作用0。本试验的结果也证实了这一结论,由此可见pH值与解磷能力关92林业科学研究第17卷系密切。图5ZB0211菌株的解磷能力曲线图4B.atr菌株的解磷能力曲线3讨论考虑到红树林生活在海岸潮间带,本研究从红树林根际直接分离解磷菌,该方法简便易行,避免过多杂菌,较土壤分离法容易筛选到与植物关系更密切的解磷菌。其它的陆生细菌也可以采用同样的方法分离。林启美等[6]从土壤中分离的解磷细菌在以磷矿粉作为唯一的磷源培养5d后,可溶性磷的含量最高可达11173Lg#mL-1。SundaraRao等[7]把Ca3(PO4)2作为磷源,经过14d的摇瓶培养,发现几株芽孢杆菌属(Bacillusspp.)释放的可溶性磷含量为70152~156180Lg#mL-1。Promod等[8]发现海洋底泥中的磷细菌Vibriosp1和Pseudomonassp1在它们的对数生长期间,可溶性磷的含量为0150~0155mg#L-1。Craven等[9]报道,分离自海藻(ZosteramarinaL.)根际的1株未经鉴定的溶磷细菌的可溶性磷含量高达300mg#L-1。本试验分离得到解磷能力较强的磷细菌,其可溶性磷含量为107~160mg#L-1,为以后进行红树人工林恢复试验提供了优良菌株。在试验过程中还发现,引进菌株在该次试验中的转化率比刚引进时有所下降,Kucey[10]也发现在菌株纯化以及传代保存过程中有近50%的解磷细菌失去了其解磷能力,因此解磷菌的合理保存以及菌株复壮有待近一步研究。微生物的解磷机制现在还不完全清楚,但一般认为是由于微生物分泌出有