糊状光合细菌的生长培养与特征

糊状光合细菌的生长培养与特征摘要:糊状光合细菌制品所用菌种,经鉴定属球形红假单胞菌(Rhodopdedomonasspheroides)。在增殖培养后,浓缩成糊状光合细菌,再培养7~9d后,吸收光谱值(OD)可达到1.908,其产品跟踪检测浓缩比可达到40B1,水分含量小于94%,生物量为1.2%~2.0%,比活率为95%~203%。经2年贮藏,糊状光合细菌的复活性能及技术指标稳定,不影响使用价值。关键词:糊状光合细菌;培养;球形红假单胞菌球形红假单胞菌(Rhodopdedomonasspheroides),大多数单个,稍有成链二分裂繁殖,细胞以球形为主。可在简单的有机物和无机盐培养液中补加硫胺素等生长因子的培养基上生长。在鱼(虾)类生活的水域中,经常有排泄物和分解产物污染水质。球形红假单胞菌能利用此种物质而得到增殖,并可使水质净化、病菌难以发展,从而改善养殖环境。研究使用证明,液体状态的光合细菌,在水产养殖池中使用时,菌体细胞自然沉降困难;保质期较短,包装运输成本偏高。经过2年的研究,开发生产出1种糊状的光合细菌,使之性质得以改善。收稿日期:1998-12-17作者简介:常仁亮(1941-),男,湖北武汉人,中国水产科学研究院东海水产研究所副研究员,从事水产食品加工及水产动物营养剂研究。1材料和方法1.1菌株样品由东海水产研究所、上海水产大学5光合细菌的生产性应用推广6课题组提供。1.2培养基种子培养基采用(RCVBN培养基)[1]。敞开式富集培养基成分为:CH3COONa,3g/L;NaCl,0.1g/L;(NH4)2SO4,0.3g/L;MgSO4#7H2O,0.2g/L;KH2PO4,0.5g/L;K2HPO4,0.3g/L;柠檬酸铁3.35mg/L。1.3培养条件光照厌氧培养,采取人工连续光照,光量强度约1000lx,温度28~32e;敞开式培养,采用静置培养,每日早晚搅拌1次;种子培养,采用封闭式连续搅拌培养。1.4糊状光合细菌原菌液的制备取自液体培养的光合细菌菌液,用电位仪测定菌液的电位决定离子(Pdi)。一般情况下,经过7d培养的菌液的Pdi为32mV。添加絮凝剂使Pdi至-132mV,在弱碱的作用下使菌液中Pdi升至+132mV。形成絮状后调节Pdi为32mV。经陈化、过滤即形成糊状光合细菌产品。1.5糊状光合细菌的培养将上述光合细菌浓缩后,浓缩比为40B1,取26g左右糊状光合细菌,加入7000ml的培养液,以15%接种量液体光合细菌培养为对照。1.6生长状态的测定1.6.1培养周期生长情况糊状光合细菌的培养周期一般为7d。每隔24h测定1次生长情况,测定其OD660nm值。1.6.2pH对生长影响的测定初始pH和生长过程中pH,都能影响菌体的生长,同时也能反映培养液的污染情况[2]。采用ZD-2型自动电位滴定测定pH。1.6.3糊状光合细菌的水分测定、生物量(干菌丝)和比活率的测定水分和生物量按常规方法测定。比活率测定是将糊状物解吸后,在培养液中培养后测定OD660nm值[3]。取5组糊状光合细菌样品,前3组样品是当年生产的糊状光合细菌,第2组样品是存贮了1年的样品,第3组样品是存贮了2年的样品,对照组采用新鲜菌种培养。接种是按生产方式15%种子量接种,培养时间7~9d。2结果与讨论2.1糊状光合细菌的生长糊状光合细菌的生长情况见图1。在封闭式容器中,用液体菌种的光合细菌,经过24h培养OD值可以达到0.43。再经过96h培养,即120h可以达到OD660nm峰值1.78,每周可以收获1次,生长周期一般为7d。经浓缩后的糊状光合细菌,按相同的比例接种,70h内生长缓慢,78h后OD值可达到0.75,再经过147h培养OD值可达到1.908。说明糊状光合细菌在培养液中约有3d的缓释过程。经过缓释后的菌体生长比未浓缩的菌体生长繁殖旺盛。图1糊状光合细菌(PS)和液体光合细菌(LS)的OD生长曲线(培养温度30e,光强1000lx,生长周期216h,厌氧)Fig.1Growthcurvesofpastyphotosyntheticbacteriaandliquidphotosyntheticbacteria2.2光合细菌浓缩后吸光值回归分析光合细菌浓缩前后吸光值测定结果见表1。表1糊状光合细菌OD值Table1ODvalueofpastyphotosyntheticbacteria(N=16)取样时间Samplingtime样品号SampleNo.12345678910111213141516浓缩前BeforeenrichedX1.3261.7211.7521.3391.3511.0241.7071.4251.3181.6371.7071.0551.6561.4941.9091.863浓缩后AfterenrichedY1.942.152.151.6751.681.502.511.8681.712.162.161.5042.022.162.302.30平均Mean^Y1.762.152.181.781.791.472.141.861.762.072.141.502.091.9242.332.29根据线性回归式:Y=A+BXB=nEXY-EYnEX2-(EX)2A=EY-BEXnr=nEXY-EXEY|nEX2-(EX)2|#|nEY2-(EY)2|X-光合细菌浓缩前的OD值;Y-光合细菌浓缩后的OD值。运用上面公式将浓缩光合细菌最终吸光值(OD)计算如下:^Y=0.4634+0.980X(r=0.9648)通过比较,这些数据的相关性好,在实际应用中可以给予实施。3应用与效果3.1糊状光合细菌的质量指标自1994年开始试制糊状光合细菌以来,累计生产了6t多糊状光合细菌,相当于250t液体光合细菌液。分销秦皇岛、河北三野、上海郊区、锦州市太、海盐市等地及马来西亚。主要用于虾、蟹育种、扇贝育苗、斑节对虾水质净化以及甲鱼越冬各期水质净化,收到了较理想的效果。产品技术指标为:浓缩比(W/W),40B1;生物量,1.5%~2.0%;比活率,95%。651期常仁亮等:糊状光合细菌的生长培养与特征3.2糊状光合细菌技术指标跟踪测试在15批产品中,监测了糊状光合细菌的质量指标如表2。表2糊状光合细菌跟踪测试指标Table2Traildetectiveindexesofpastyphotosyntheticbacteria序号Order光合细菌Photosyntheticbacteria体积VolumeOD湿重/gWetweight干重/gDryweight纯度/%Purity水分/%Watercontent沉淀剂/gDryweightofflocculation菌丝净重/gNetweightofhypha生物量/%Biomass备注Note12000.5705.07680.26255.170694.830.17050.09211.812222000.6815.19380.31246.014993.990.17050.14192.732132000.8655.17010.22274.307595.690.10670.11602.242745000.88312.6950.56274.432595.560.40330.15941.255652001.0184.98400.27425.501694.500.14350.13072.622465001.07612.1170.58934.863695.140.40330.18601.535172001.1944.90250.26525.410094.590.10670.15853.233682001.2855.30830.29625.579994.420.14350.13072.876692001.2964.98780.34696.955093.050.17660.17033.4144102001.2964.89190.27775.676794.320.14350.12803.4955112001.3484.79440.27155.662994.340.14350.12802.6698122001.4164.78150.27275.703294.300.14350.12922.7020132001.5265.15780.31216.051093.950.14960.16523.2029141001.6992.61130.16656.376193.620.09720.06932.6538155001.69912.3870.85676.916393.080.59600.26072.1046波长660nmWavelength比色杯Opticallength1cm通过质量跟踪调查,糊状光合细菌产品的浓缩比基本上稳定在40B1。经浓缩后的光合细菌,不仅仅减少了包装和运输成本,重要意义在于使用方便。经解吸后的糊状光合细菌在养殖池中形成一种絮状悬浮物,均匀布置在养殖池的底层,使菌体能获得自身所需养分,并改善了水质。在养殖池换水时,避免了光合细菌的流失。浓缩光合细菌产品中干物质量占总量的0.111%~0.200%。干物质包括细菌干重和培养液中溶质的干重。经过收集的糊状光合细菌(湿重),占总容积的比率在4.3%~6.9%之间。将糊状光合细菌解吸后,再用水洗涤3次所获得的菌丝干重占总容积的比率在0.03%~0.08%之间。根据国内报道,在实验室培养的光合细菌的干重比率为1.07g/L[4]。大规模生产所获得的生物量(干重)与实验室所获得数据相差甚远。二者由于为满足培养条件所用手段不同,处理干重的方法也不同,故导致了数据上的差异。在光合细菌的试验培养和规模化培养中,通常采用菌体细胞内细胞器的吸收光谱值(OD)来表达菌体含量。其实菌绿素a的光谱分析,吸收峰值是530.0nm、690.0nm和760.0nm[5]。采用1cm比色杯,波长660nm处OD值是以上3个峰值的平均值。所以,在不同的文献资料中采用不同厚度的比色杯和不同的波长,所获OD值不同。3.3糊状光合细菌的贮藏和比活率测定3.3.1糊状光合细菌的包装形态和贮藏方法在生产制备过程中,将絮状沉淀物进行陈化,其目的是去除小的絮状颗粒之间水分子,使胶状沉淀物更稳定,有利于过滤。将过滤后的糊状光合细菌产品分装于250g、550g塑料瓶并装于20kg、25kg桶装,加盖密封,常温贮藏备用。3.3.2糊状光合细菌的比活率测定糊状光合细菌产品经过贮存,其表观形态比液体光合细菌产品表现出更具耐藏性。色泽、菌体均匀度、无污染等特征都十分明显。它的商品价值,即经过贮藏后糊状光合细菌的使用价值,与液体光合细菌比较是否有显著的变化,需采用比活率测定来说明,即每单位种子菌量的增加率(表3)。从表3可以看出,其比活率不低于94%,完全达到新制订的产品标准。经过1~2年存贮后,比活率可达127%~155%。存贮后的产品比活率和表观形态-感官指标是一致的,说明糊状光合细菌具有耐藏性特征。66中国水产科学7卷表3糊状光合细菌贮藏期比活率比较Table3Thecomparationofgrowthrateofpastyphotosyntheticbacteriaduringstorage取样时间Samplingtime编号No~菌种吸光值StrainsOD培养终止吸光值EndOD增加值ODincrement单位增加值UnitODincrement试验组Exp.对照组Control试验组Exp.对照组Control试验组Exp.对照组Control试验组Exp.对照组Control比活率/%Growthrate当年样品Thefirstyear11.291.3521.892.020.60.6680.4650.49494.1320.4390.6161.9251.6411.4861.0253.381.66420330.5280.6801.9662.011.4381.3282.7231.95139贮存1年Storageforoneyear40.23贮存2年Storagefortwoy