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环境工程微生物学实验指导书使用专业：环境科学与环境工程使用院系：贵州大学资源与环境工程学院编制时间：2008年8月目录1.显微镜的使用技术及细菌个体形态观察………………………………………………11.1普通光学显微镜的使用……………………………………………………………1.2细菌的形态观察2.细菌的染色和细胞构造的观察2.1简单染色法2.2革兰氏染色法2.3芽孢染色法3.放线菌和真菌的形态观察3.1放线菌的形态观察3.2真菌的形态观察4.微生物细胞大小和数量的测定4.1微生物细胞大小的测定4.2微生物细胞数量的测定5.微生物培养基的配制和灭菌5.1微生物培养基的配制5.2微生物的灭菌第一章显微镜的使用技术及细菌个体形态观察17世纪荷兰人列文虎克制造了第一台显微镜，首次把微生物世界展现在人类面前，至今已经历300余年。显微镜的问世对微生物学的奠基和发展起到了不可估量的作用。随着科学技术的发展，显微镜的种类越来越多，用途也越来越广泛。微生物学实验中最常用的是普通光学显微镜，下面将作详细介绍。第一节普通光学显微镜的使用普通光学显微镜简称光学显微镜（lightmicroscope），以平均波长为550nm的可见光作为光源，能分辨的两点距离约为0.22μm。多数细菌的个体大于0.25μm，因此可在光学显微镜下观察。由于许多细菌的大小与光学显微镜的分辨率处于同个数量级，为了看清细菌的形态与结构，经常使用油镜来提高显微镜的分辨率。在光学显微镜的使用中，油镜的使用是一项十分重要的操作技术。一、实验目的、要求1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。2、学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。3、在油镜下观察细菌的几种基本形态。4、采用悬滴法在高倍镜下观察细菌运动。二、基本原理（一）普通光学显微镜的构造普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图1-1）。1、机械系统机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。（1）镜座：它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。（2）镜臂：用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。（3）镜筒：它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。镜筒长度一般固定，通常是160mm。有些显微镜的镜筒长度可以调节。（4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜。为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜。转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。（5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后和左右移动。有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。（6）调节器：调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm。图1-1普通光学显微镜的构造1.镜座2.镜臂3.镜筒4.转换器5.载物台6.压片夹7.标本移动器8.粗调螺旋9.细调螺旋10.目镜11.物镜12.虹彩光阑（光圈）13.聚光器14.反光镜2、光学系统光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。（1）目镜：它的功能是把物镜放大的物像再次放大。目镜一般由两块透镜组成。上面一块称接目透镜，下面一块称场镜。在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。由于光阑的大小决定着视野的大小，故它又称为视野光阑。标本成像于光阑限定的范围之内，在光阑上粘一小段细发可用作指针，指示视野中标本的位置。在进行显微测量时，目镜测微尺被安装在视野光阑上。目镜上刻有5×、10×、15×、20×等放大倍数。可按需选用。（2）物镜：它的功能是把标本放大，产生物像。物镜可分为低倍镜（4或10×）、中倍镜（20×）、高倍镜（40～60×）和油镜（100×）。一般油镜上刻有“OI”（oilimmersion）或HI（homogeneousimmersion）字样，有时刻有一圈红线或黑线，以示区别。物镜上通常标有放大倍数、数值孔径（numericalaperture，简写为NA）、工作距离（物镜下端至盖玻片间的距离，mm）及盖玻片厚度等参数（图1-2）。以油镜为例，100/1.25分别表示放大倍数为100倍，NA为1.25；160/0.17分别表示镜筒长度160mm，盖玻片厚度等于或小于0.17mm。图1-2XSP-I6型显微镜物镜的主要参数（3）聚光器：聚光器又称聚光镜，它的功能是把平行的光线聚焦于标本上，增强照明度。聚光器安装在镜台下，可上下移动。使用低倍物镜（简称低倍镜）时应降低聚光器，使用油镜时则应升高聚光器。聚光器上附有虹彩光阑（俗称光圈），通过调整光阑孔径的大小，可以调节进入物镜光线的强弱（物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系见图1-3）。在观察透明标本时，光圈宜调得相对小一些，这样虽会降低分辨力，但可增强反差，便于看清标本。图1-3物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系（4）反光镜：它是普通光学显微镜的取光设备，其功能是采集光线，并将光线射向聚光器。反光镜安装在聚光器下方的镜座上，可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。反光镜的一面是凹面镜，另一面是平面镜。一般情况下选用平面镜，光量不足时可换用凹面镜。（二）普通光学显微镜的性能1、数值孔径数值孔径（NA）又称开口率，是指介质折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可用式1-1表示。（1-1）式中，n为物镜与标本之间介质的折射率，为镜口角（通过标本的光线延伸到物镜边缘所形成的夹角（图1-4）。物镜的性能与物镜的数值孔径密切相关，数值孔径越大，物镜的性能越好。因为镜口角总是小于180˚，所以sin的最大值不可能超过1。又因为空气的折射率为1，所以以空气为介质的数值孔径不可能大于1，一般为0.05～0.95。根据式1-1，要提高数值孔径，一个有效途径就是提高物镜与标本之间介质的折射率（图1-5）。使用香柏油（折射率为1.515）浸没物镜（即油镜）理论上可将数值孔径提高至1.5左右；实际数值孔径值也可达1.2～1.4。图1-4物镜的镜口角图1-5介质折射率对光线通路的影响2sinnNA22、分辨率分辨率是指分辨物像细微结构的能力。分辨率常用可分辨出的物像两点间的最小距离（D）来表征（式1-2）。D值愈小，分辨率愈高。式中，λ为光波波长。比较式1-1和式1-2可知，D可表示为：（1-3）根据式1-3，在物镜数值孔径不变的条件下，D值的大小与光波波长成正比。要提高物镜的分辨率，可通过两条途径：①采用短波光源。普通光学显微镜所用的照明光源为可见光，其波长范围为400～700nm。缩短照明光源的波长可以降低D值，提高物镜分辨率。②加大物镜数值孔径。提高镜口角或提高介质折射率n，都能提高物镜分辨率。若用可见光作为光源（平均波长为550nm），并用数值孔径为1.25的油镜来观察标本，能分辨出的两点距离约为0.22μm。3、放大率普通光学显微镜利用物镜和目镜两组透镜来放大成像，故又被称为复式显微镜。采用普通光学显微镜观察标本时，标本先被物镜第一次放大，再被目镜第二次放大（图1-6）。所谓放大率是指放大物像与原物体的大小之比。因此，显微镜的放大率（V）是物镜放大倍数（V1）和目镜放大倍数（V2）的乘积，即：V=V1×V2（1-4）如果物镜放大40倍，目镜放大10倍，则显微镜的放大率是400倍。常见物镜（油镜）的最高放大倍数为100倍，目镜的最高放大倍数为15倍，因此一般显微镜的最高放大率是1500倍。图1-6普通光学显微镜的成像原理22nsinDA2ND（1-2）4、焦深一般将焦点所处的像面称为焦平面。在显微镜下观察标本时，焦平面上的物像比较清晰，但除了能看见焦平面上的物像外，还能看见焦平面上面和下面的物像，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深与数值孔径和放大率成反比，数值孔径和放大率越大，焦深越小。因此，在使用油镜时需要细心调节，否则物像极易从视野中滑过而不能找到。三、实验器材1、菌种：培养12～18h的枯草杆菌斜面（Bacillussubtilis）3～4支。2、标本片：细菌三种基本形态的染色标本(1套/组)，特殊形态细菌染色标本(示范镜)。3、仪器及相关用品(1套/组)：显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸。4、其它用品(1套/组)：盖玻片，凹玻片，吸水纸，酒精灯，接种环，牙签，凡士林。四、实验程序（一）显微镜（油镜）操作1、领取并检查显微镜：按学号向实验指导老师领取显微镜，所有实验课均对号使用。从显微镜箱中取出显微镜时，用右手紧握镜臂，左手托住镜座，直立平移（图1-7），轻轻放置在实验台上（图1-8），检查各部件是否齐全，镜头是否清洁，有问题及时报告老师。图1-7显微镜的搬动图1-8显微镜的放置光源：良好的照明是保证显微镜使用效果的重要条件。将低倍镜旋转到工作位置，用粗调螺旋提升镜筒，使镜头距离载物台10mm左右，降低聚光镜的位置，完全打开虹彩光阑，一边看目镜，一边调节反光镜镜面的角度（在正常情况下，一般用平面反光镜；若自然光线较弱，则可用凹面反光镜）。然后，调节聚光器的位置（酌予升降），直至视野内得到均匀适宜的亮度。3、低倍镜观察：使用低倍镜观察，视野较广，焦深较大，便于搜寻目标，因此宜从低倍镜开始观察。将载玻片标本（涂面朝上）置于载物台中央（图1-9），用压片夹固定（图1-10），并将标本部位移到正中，转动粗调螺旋（图1-11），使镜头与标本的距离降到10mm左右。然后，一边看目镜内的视野，一边调节粗调螺旋缓慢升高镜头，至视野内出现物像时，改用细调螺旋（图1-12），继续调节焦距和照明，以获得清晰的物像，并将所需部位移到视野中央，再换中、高倍镜观察（图1-13）。图1-9将载玻片标本置于载物台中央图1-10用压片夹固定载玻片标本图1-11转动粗调螺旋图1-12转动细调螺旋图1-13转换物镜4、中、高倍镜观察：依次用中、高倍镜观察低倍镜下锁定的部位，并随着物镜放大倍数的增加，逐步提升聚光器增强光线亮度。找出所需目标，将其移至视野中央。5、油镜观察：将聚光器提升至最高点，转动转换器，移开高倍镜，使高倍镜和油镜成“八”字形，在标本中央滴一小滴香柏油，把油镜镜头浸入香柏油中，微微转动细调螺旋，直至看清物像。如果油镜上升至离开油面还未看清物像，则需重新调节。可从侧面注视，小心地转动粗调节器将油镜重新浸在香柏油中，但不能让油镜压在标本上，更不能用力过猛，击碎玻片，损坏镜头。6、调换标本：观察新标本片时，必须重新从第3步开始操作。7、用后复原：观察完毕，转动粗调螺旋提升镜筒，取下载玻片，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸取少许二甲苯（香柏油可溶于二甲苯）擦去镜头上的残留油迹，再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯，最后用细软的绸布擦去机械部件上的灰尘和冷凝水。降低镜筒，将物镜转成“八”字形置于载物台上。降低聚光器，避免聚光器与物镜相碰。使反光镜垂直于镜座，以防受损。将显微镜放回显微镜箱中锁好，并放入指定的显微镜柜内第二节细菌形态观察一、结合显微镜（油镜）的使用，观察三个细菌染色片（球菌、杆菌和螺旋菌，如图1-14所示），并绘图。图1-14球菌、杆菌和螺旋菌2、看示范镜，观察双球菌和四联球菌（如图1-15所示），并绘图。图1-15双球菌和四联球菌（三）细菌运动性观察有些细菌具有鞭毛，能在水中自由运动。细菌运动常用水浸片法和悬滴法观察。1、水浸片法用接种环取培养12～18h的枯草杆菌菌液一环，置于干净的载玻片中央，盖上盖玻片（图1-16，注意不使产生气泡），用低倍镜找出目标后，再换用中倍至高倍镜观察。图1-16水浸片的制备2、悬滴法取一洁净的盖玻片，用牙签挑取少量凡士林，涂于盖玻片四角；再按无菌操作要求，用接种环从斜面底部取培养12～18h的枯草杆菌菌液一环，置盖玻片中央（菌液呈水珠状）；接着取凹玻片一块，将凹窝向下覆盖在带有菌液的盖玻片