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挥发性脂肪酸的测定一、GC（Gaschromatograph）工作条件仪器：GC-14B型气相色谱仪（日本岛津公司）毛细柱：NUKOLTMCapillaryColumn(Supelco)；ColumnNo.34292-07B30m×0.32mm×0.25μmfilmthickness气相色谱仪参数：色谱柱采用毛细吸管柱，柱温130℃，汽化温度180℃，采用氢离子火焰检测器，检测温度180℃，载气为氮气，压力为60KPa，氢气压力为50KPa，氧气压力50KPa，灵敏度（档）为101，衰减3.0二、样品制备1．试剂制备（1）配制25%w/v的偏磷酸溶液，将25g偏磷酸溶在100mL双蒸水中（2）巴豆酸的配制，在100ml的偏磷酸溶液中加入0.6464g的巴豆酸，定容到100mL。（可先用80ml双蒸水，加热溶解偏磷酸，然后定容至100ml）（3）标准样品，准确称取色谱标准级乙酸0.9100g、丙酸0.3700g、丁酸0.1765g、异丁酸0.1765g、戊酸和异戊酸分别为0.1985g，分别溶于双蒸水中，再各自定容至100mL。2．样品制备(1)发酵液取（或过滤瘤胃液）VFA测定1ml样品到离心管中，再加入0.2ml的偏磷酸巴豆酸混合溶液，－20℃冰箱保存过夜，解冻后12000rpm离心5min，取上清液保存，测定前再12000rpm离心5min(或少许通过0.22μm针式滤器，滤液直接进样用1.0微升微量进样器瞬时注入色谱仪，进样量为0.2－1.0μL。(2)食糜及粪样VFA测定取1g置于离心管中，加入5－10倍的双蒸水，混合均匀。取1mL上清夜，加偏磷酸巴豆酸0.2mL/mL。其它步骤同上。3．保留时间的确定与样品处理相同，在1ml标准样品中加入0.2mL偏磷酸与巴豆酸的混合样，上样测出乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的保留时间。4．有机酸浓度的计算通过标准样品和内标巴豆酸各自的（或浓度）和峰面积可以计算出乙酸、丙酸及丁酸等有机酸的相对校正因子，然后根据乙酸、丙酸及丁酸的重量（或浓度）与其峰面积成正比计算出各个样品中的乙酸、丙酸及丁酸浓度。（样品某酸峰面积值×巴豆酸标样峰面积×某酸标样浓度）某酸浓度(mM)＝（样品中巴豆酸面积值×标样某酸峰面积）挥发酸标样的质量和换算的浓度标样浓度质量/g/100mL分子量浓度/mM巴豆酸0.646486.0975.08421乙酸0.924660.05153.9717丙酸0.371374.0850.12149丁酸0.178788.1120.28147异丁酸0.17488.1119.74804戊酸0.1904102.1418.64108异戊酸0.205102.1420.070495．有机酸重现率将某有机酸（如乙酸）连续上样几次，测定其峰面积值，利用某酸峰面积值和内标峰面积值计算其重现率。乙酸重现率变异系数：1.2872±0.06404丙酸重现率变异系数：0.5104±0.01961丁酸重现率变异系数：0.3422±0.01037异丁酸重现率变异系数：0.4668±0.01447戊酸重现率变异系数：0.1431±0.01754异戊酸重现率变异系数：0.1671±0.034966.不同标样有机酸的GC峰形乙酸巴豆酸丙酸异丁酸戊酸丁酸异戊酸混合标样样品标样的分子量和出峰时间沸点分子量出峰时间巴豆酸86.091.95min乙酸118℃60.050.87min丙酸141℃74.081.0min丁酸163.5℃88.111.2min异丁酸154.5℃88.111.06min戊酸102.141.68min异戊酸102.141.38min气相色谱的气体工作条件（VFA测定）乙酸丙酸异丁酸丁酸异戊酸戊酸巴豆酸钢瓶减压阀压力气象色谱压力表氢气0.14MPa50KPa空气(AIR1)0.4MPa50KPa氮气（ARRIER2）0.4MPa60KPaPRIMARYCARRIER(P)300KPa消化道微生物研究室南京农业大学动物科技学院2007.9.28