基因工程2第二节重组DNA技术

第二节重组DNA技术一、重组DNA技术相关概念（一）DNA克隆克隆（clone）：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化（cloning）：获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。分子克隆（DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。又称基因克隆或重组DNA。基因工程：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作，又称为重组DNA技术(recom-binantDNAtechnology)。（二）工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶I逆转录酶DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。······GGATCC············CCTAGG······5'5'3'3'限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：钝性末端(bluntend)粘性末端(stickyend)HindIIIBamHIGCCTAGGATCCG+GTCCAGGACCTG+GTCGACCAGCTGGGATCCCCTAGG5´-端突出粘性末端3´-端突出限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatibleend），可用连接酶连接。AATTCG5'3'ACGTCG5'3'（三）目的基因应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。1.cDNA(complementaryDNA):是指经反转录合成的，与RNA互补的单链DNA。以单链cDNA为模板，经聚合反应可合成双链cDNA。2.基因组DNA（genomicDNA）：是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体及线粒体）的所有DNA序列。（四）基因载体（vector）能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的可独立复制的完整DNA分子。又称克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载体。常用的载体：质粒、噬菌体DNA、病毒DNA载体的选择标准：•能自主复制；•具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；•有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；•分子量小，以容纳较大的外源DNA。1.质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。2.噬菌体（phage）DNAλ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列3.其他柯斯质粒（cosmid）酵母人工染色体载体（yeastartificialchromosome,YAC）细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）二、重组DNA技术基本原理（一）目的基因的获取1.化学合成法用于已知序列，或可推导出序列的基因2.基因组DNA基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）3.cDNAcDNA文库（cDNAlibrary）4.聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）基因组DNA文库存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。简称G－文库。组织或细胞染色体DNA限制性内切酶基因片段克隆载体重组DNA分子受体菌含重组分子的转化菌cDNA文库用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。简称c－文库。mRNA逆转录酶cDNA复制双链cDNA载体重组DNA分子受体菌含重组分子的转化菌PCR是根据DNA复制的原理，在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术。PCR的反应体系：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP及含有Mg2＋的缓冲液。PCR的基本反应步骤：1.变性：将反应系统加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链；2.退火：将温度下降至50℃左右，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸：将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经25～30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。（二）克隆载体的选择（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCGGCCTAGGATCCGDNA连接酶GCCTAGGATCCG2.平端连接限制性内切酶作用产生的平端粘端经特殊酶处理变为平端3.同聚物加尾连接由末端转移酶作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。4.人工接头由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。（四）重组DNA导入受体菌受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态导入方式：转化转染（transfaction）感染（infection）（五）重组体的筛选重组DNA导入受体菌后，经过培养使其大量繁殖，再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选（screening）或选择（selection）。1.直接选择法：针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。其特点是直接测定基因或基因表型。抗药性标记选择（插入失活法）：将目的基因插入带ampr和tetr基因载体的tetr基因中，则tetr基因失活。在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养，进行筛选。标志补救（markerrescue）若目的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对营养素的依赖表型来筛选。分子杂交法：利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接选择并鉴定目的基因。原位杂交Southern印迹2.非直接选择法：免疫学方法：利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选。包括：免疫化学方法酶免检测法（六）克隆基因的表达表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离、纯化1.原核表达体系E.coli的标准：选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点E.coli的不足：缺乏转录后加工机制缺乏翻译后加工机制表达产物形成不溶性包涵体很难表达大量可溶性蛋白2.真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区积累缺点：操作技术难、费时、不经济转染：将表达载体导入真核细胞的过程三、重组DNA技术与医学的关系•疾病基因的发现•发展生物制药•DNA诊断•基因治疗•遗传疾病的预防复习思考题：1.概念：（1）克隆（2）转化（3）转位（4）基因工程（5）转座（6）限制性核酸内切酶（7）载体（8）G文库（9）质粒（10）c文库2.简述基因工程的基本过程。3.简述目的基因的主要来源或途径。