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实验六纸层析法观察转氨基作用【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用09救援一班第三大组李岚宇2009222336室温：28°（一）实验目的：1、学习氨基酸纸层析的基本原理。2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。（二）实验原理：转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：α—酮戊二酸+丙氨酸ALT谷氨酸+丙酮酸本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示：物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。（三）实验材料与仪器：试剂：1、0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液。2、0.2mol/LNa2HPO4溶液81ml与0.2mol/LNaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至100ml。4、0.1mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后，加磷酸盐缓冲液至100ml。5、0.1mol/L谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至50ml。6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100ml丙酮中溶解。7、层析溶剂：将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。（四）实验步骤:1、肝匀浆制备：取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液1.0ml,迅速研成匀浆，用上述缓冲液4.5ml混匀备用。2、酶促反应过程（1）取离心管两支，编号：1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆0.5ml。把对照管放沸水浴中加热10分钟，取出冷却。（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5ml,0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5ml,0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液1.5ml,摇匀。（3）37℃保温，30分钟后取出，保温完毕。（4）把测定管放沸水浴中煮10分钟，取出后冷却，过滤。3、层析（1）取圆形滤纸一张（直径9cm）放洁白纸上，以圆点为中心，约1cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。（2）点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处。把测定液、对照液分别点在原点1、3处。注意斑点不宜过大（应在直径0.5cm以下）。在第一次点样点干后，再在原处同样点第2次。（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。（4）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培养皿盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。当层析液前缘到离滤纸边缘约1cm时，约25分钟，取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。（5）显色：将上述滤纸平放在培养皿上，滴0.5％茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。（五）实验结果记录：图（1）表格（1）（六）实验讨论：1、从表格（1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据Rf值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质b为谷氨酸，则未知溶质a为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。2、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。3、层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛。4、点样点不宜过大，直径小于0.5cm.2010年9月19日点样溶液色斑个数溶质中心到原点中心的距离溶质前缘到原点中心的距离Rf值测定管上清液2未知溶质a1.50cm2.50cm0.6未知溶质b0.40cm2.50cm0.16丙氨酸11.30cm2.20cm0.6对照管上清液11.50cm2.50cm0.6谷氨酸10.40cm2.20cm0.16