第五章毛细管电泳

第五章毛细管电泳法Highperformancecapillaryelectrophoresis毛细管电泳的基本概念及主要应用毛细管电泳毛细管电泳指一系列以内径10～200μm的毛细管柱为分离通道，以高压直流电为分离动力对大分子和小分子等进行高效分离和检测的有关技术的统称毛细管电泳和传统电泳的区别传统的电泳是在平板凝胶的两端加上一定的电压使组分分离毛细管电泳是在散热效率极高的毛细管内进行，它可以加上0～30KV的高电压进行分离，达到快速、高效毛细管电泳的特点毛细管的特点容积小，以100㎝长、75μm内径的毛细管计，容积仅为4.4μl侧面/截面积比大，使毛细管散热快，能承受100～1000V/cm的高电场能使用自由溶液、凝胶等作为支持介质在溶液介质下能产生平面形状的电渗流毛细管电泳的特点(续）毛细管电泳的特点高效：区带电泳中，柱效一般为几十万～几百万理论塔扳/米快速：多数分析在10分钟内完成，有的可以在60秒内完成高灵敏度：紫外检测器10-13～10-15mol荧光检测器10-19～10-21mol微量：进样量1～10nL样品量5ul～5mL检测:在线检测毛细管电泳的特点（续）重现性:迁移时间0.5%经济：实验消耗不过几ml缓冲液，没有泵输送系统样品对象广：从无机离子到整个细胞，具有包罗“万能”的分析功能和潜力自动：CE是目前自动化程度最高的分离方法自动进样，缓冲液交换，数据处理洁净：毛细管电泳与平板凝胶电泳的比较毛细管电泳平板凝胶电泳检测器选择多少定量与HPLC相当困难自动化容易困难分辨率高低毛细管电泳与HPLC的比较相同之处：1.快速高效分离技术2.可定量3.全自动化4.可用不同模式5.在许多领域逐步取代HPLC毛细管电泳与HPLC的比较不同之处:毛细管电泳HPLC1、根据电泳淌度差异保留时间差异2、分离效率(N)与扩散系数（D）成反比与扩散系数（D）成正比3、样品量纳升（nl）级微升（ul）级4、检测在线检测柱后检测5、制备量微量制备常量制备毛细管电泳的主要应用手性化合物碱性药物分子法医毒物/临床毒理蛋白质/多肽/氨基酸糖类/糖蛋白核酸/核苷酸无机及有机离子/有机酸其它小分子水溶液中分子间的相互作用单细胞分析药物与细胞的相互作用分析与微量制备手性/异构体拆分方法简单化改善分辨率快速成本降低方法开发过程简单碱性药物分析—19种混合碱性药物的质量控制分析在其它药物分析中的应用主成分的定量测定痕量杂质检测中药材成分分析/指纹图谱中药复方制剂中化学成分测定药物计量离子配比测定药物代谢产物测定药物与蛋白质的相互作用研究滥用药物测定药厂质控在蛋白质和多肽分析中的应用肽、蛋白和糖蛋白的鉴别结构分析纯度检测非均一性、多样性研究稳定性研究结合和动力学研究定量测定等电点测定蛋白质和多肽的质量控制微量制备在糖类/糖蛋白中的应用多糖谱图的制定水化合物分离及测定蛋白分析构体分析糖脂研究在核酸/核苷酸分析中的应用核酸、基因疫苗的质量控制碱基、核苷和核苷酸的分析纯度检测、片段收集和微量制备PCR产物分析和dsDNA分析蛋白质-DNA相互作用测定基因突变测定基因表达测定DNA序列测定(CEQ2000XL)在临床医学中的应用临床疾病诊断临床蛋白分析基因诊断病毒检测临床药物检测药物代谢研究临床分子生物学测定毒物、滥用药物测定CE/MS/MS联用技术及应用药物的结构药物及其代谢产物分析蛋白质和多肽结构蛋白质酶解产物测定核苷酸、DNA结构其它领域的应用在其它工业领域中的应用药品纯度及杂质检测石油化工产品杂质监测食品中有机酸检测及矿物质分析环境污染物分析金属阴和阳离子、无机离子检测烟草中成分检测纺织染料的测定表面活性剂测定毛细管电泳存在问题使用了小管径的毛细管，制备能力差光路短，要用高灵敏度的检测器检测样品凝胶、色谱填充管要用专门的灌制技术大的侧面/截面积比会“放大”吸附的作用，导致蛋白质等的分离效率下降或无峰吸附会引起电渗的变化，进而影响分离重现性毛细管电泳与HPLC的互补结合应用逐步代替许多HPLC的功能——手性拆分、蛋白质分析、碱性药物、DNA分析、毛细管电泳中药指纹图谱、药物的质量控制、杂质测定在制备功能上是互补的：HPLC强调较大的制备量CE强调可获得极高的纯度基本理论分离原理高效毛细管电泳是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按淌度或/和分配系数不同进行高效,快速分离的一种电泳新技术例：以应用最多的毛细管区带电泳（CZE）为例在移动过程中，由于样品组分间的淌度不同，它们的迁移速度不同，所以经过一定时间后，各组分就按其速度或淌度的大小顺序，依次到达检测器检测窗口被检出，这样就可以得到按时间荷响应值（A）分布的电泳谱图分离原理毛细管和电泳槽中充有相同组分和相同浓度的背景电介质溶液，样品从毛细管的进样端导入。当毛细管两端加上一定的电压后，荷电溶质便朝着与其电荷极性相反的电极方向移动。毛细管电泳预备知识偶电层和Zeta电势偶电层是浸没在液体中的所有表面都具备的一种特性，通常是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子组成的与表面电荷异号的离子层按照近代偶电层模型，在偶电层溶液一侧由两层组成：第一层：吸附层，又称为斯特恩（Stern）层或紧密层（Compactlayer）第二层：扩散层diffuselayerψ0为表面电势，它在stern层中线性地降到Ψd，它是stern面和溶液内部的电势差，和特性吸附离子的性质和数量有关。在stern面外侧很近的地方有一剪切面，是紧贴在固相表面粘度迅速变化的区域，我们把剪切面上的电势称为zeta（ξ）电势，其值略低于Ψd，公式计式中：e—溶液中每单位面积总的过剩电荷ε—介质的介电常数δ--扩散层的厚度，它和电介质浓度（C）有关，确切地说，和溶液的离子强度有关e4毛细管电泳中的zeta电势第一种：毛细管壁上的zeta电势熔硅毛细管表面上的zeta电势正比于它表面上的电荷数与对离子层厚度的乘积，但电荷数和对离子层厚度又会受到对离子的性质、缓冲液的pH、缓冲液中阳离子和熔硅基表面间的平衡等因素的影响。对于熔硅或聚四氟乙烯材质的毛细管，管壁上的zeta电势是毛细管电泳中的一个重要参数，对控制电渗流、优化毛细管分离有重要意义。毛细管电泳中的zeta电势第二种：荷电粒子表面上的zeta电势在电介质中，任何带电粒子都可以被看成是一个偶电层系统的一部分。在这个系统中，粒子自身的电荷被异号的带电离子中和，这些异号离子中有一些被不可逆地吸附到粒子上，而另一些则游离在附近，并扩散到电介质中进行离子交换。“固定”离子有一个切平面，它和离得最近的游离离子间的电势称为粒子的zeta电势。电泳在半导体中，荷电粒子在外电场作用下的泳动现象称为电泳（electrophoresis）.带电粒子在电场中受到向前的力FF=q×E同时，带电粒子受到粘滞阻力F’F’=f×u当F=F’，粒子以稳态速度运动，有：u’=qE/f对于球形粒子，f由stokes定律给出，f=6×r,有：ErqEue66'电泳（续）根据上式，电泳速度是和外加电场有关，所以电泳中常用淌度（mobility,）来描述荷电粒子的电泳行为和特性.电泳淌度（ep）定义：单位场强下离子的平均电泳速度影响荷电粒子在电场中的迁移速度的因素有：电场强度、介质性质、粒子的荷电情况、粒子的大小和形状6eepEu电渗（electroosmoticflow,EOF）电渗流是一种液体相对于带电的管壁移动的现象。在毛细管电泳里在所指的电渗是：在高电压下，溶液中的正电荷与毛细管管壁表面的负电荷之间作用，引起流体朝负极方向运动的现象。和电泳淌度相似，电渗淌度（eo）可表示为：Euweo4在普通的毛细管区带电泳条件下，电渗流从阳极流向阴极，大小受到Zeta电势、偶电层厚度、介质粘度的影响，一般电势愈大、偶电层愈薄、粘度愈小，电渗流值就愈大。通常，渗流速度是泳流速度5～7倍电渗（续）粒子在毛细管中同时受到泳流和渗流两种运动速度的影响，粒子在毛细管电介质的运动速度应该是两种速度的矢量和：令μapp=μep+μeo为表现淌度（apparentmobility）或净淌度(netmobility)Euuueoepeoep)(电渗（续）从毛细管电泳测量中得到的淌度应为粒子自身的电泳淌度和由电渗引起的淌度的矢量和：式中：Ld-毛细管从进样口到检测器的距离tm-粒子通过毛细管到达检测器的时间Lt-毛细管柱长，V-电压VtLLEeoepappmtd粒子的表观淌度电渗（续）通过以上讨论可得：表现淌度μapp可以从毛细管电泳的测量结果求得电渗淌度μeo可以用中性粒子按同样的方法测得电泳淌度μep带电粒子的电泳淌度可用中性粒子为参照从式中求得电渗（续）各带电离子在毛细管中的流出顺序为：正离子——运动方向与电渗一致中性粒子——泳流速度为零，随电渗而行负离子——运动方向与电渗相反，当μeo＞μep时，最后流出，否则无法流出结论：只有当电渗速度的绝对值大于所有负离子泳流速度的绝对值时，混合物中的所有组分才将向一个方向迁移，才能检测出所有组分毛细管电泳流型毛细管电泳是属于电驱动系统，在毛细管中流体的流型呈扁平型的塞子向前流动。毛细管电泳的分类及主要应用方向按分离机理分：毛细管区带电泳（CZE）毛细管凝胶电泳（CGE）毛细管等电聚焦（CIEF）毛细管电动色谱（EKC）毛细管胶束电动色谱（MECC）毛细管电色谱（CEC）毛细管等速电泳（CITP）亲和毛细管电泳（ACE）非水相毛细管电泳（NACE)各种电泳的主要应用方向小型离子:CZECITP小分子:MECCCZECITP肽类:CZEMECCCIEFCITPCGE蛋白质:CZECGECIEFCITP低聚核苷酸:CGEMEKCDNA:CGE毛细管电泳仪毛细管电泳仪的基本结构毛细管电泳系统包括：进样、填灌/清洗、电流回路、毛细管/温度控制、检测/记录/数据处理等部分毛细管电泳仪的性能多种灵活的分离模式电压、电流、功率、压力和真空可恒压、恒流、恒功率或梯度编程可压力与电压、电流、功率的组合可程序控制切换极性毛细管电泳仪的性能控温范围宽，至少应能够在20～40℃内恒温可选择的样品温度控制系统半导体的温控系统可供选择样品温度控制与缓冲液的温度控制分开样品量可达192个恒温精度能到达±0.1℃毛细管电泳仪的性能准确、自动的进样系统性具有精确的进样控制和校正系统，进样量准确可直接从96孔样品板上自动进样，也可从2ml或0.5ml或PCR试管中进样可电动、压力、真空或三者组合进样可从毛细管两端的任一端进样进样后，有等待功能毛细管电泳仪的性能最佳的缓冲液供给系统可容纳36种缓冲液组合功能缓冲液的温度控制与样品的温度控制分开还有备选的4x25ml的大容量缓冲液瓶可供选择毛细管电泳仪的性能配备性能优良的检测器，以满足不同的应用二极管阵列检测器（DAD）紫外检测器（UV/VIS）激光诱导荧光检测器（LIF）通用型外部接口（EDA），连接串联质谱检测器（MS/MS）电导检测器（Conductivity）等进样进样必须满足的要求：进样时不能引入显著的区带扩张样品的量必须小于100nl，否则会引起过载进样方式真空进样电进样压力进样进样--电动进样（电迁移进样）电动进样属于普适性方法，是凝胶电泳进样唯一的方法缺点：对离子组分存在进样偏向，即进样歧视进样--压力进样方法：压力进样也叫流动进样，要求毛细管中的填充介质具有流动性，也即当把毛细管的两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，将样品带入。进样--压力进样三种方式：正压负压（管尾抽吸）重力（虹吸）正压进样的优点进样过程中没有组分歧视，在严格控制样品的粘度和