毛细管电泳三种前沿应用的简介

毛细管电泳三种前沿应用的简介李曼琳0940120毛细管电泳三种前沿应用的简介一．毛细管电泳—电化学发光分离检测技术二．毛细管电泳-质谱联用技术三．非水毛细管电泳四．结论与展望毛细管电泳（CE）简介毛细管电泳，亦称高效毛细管电泳，是以高压电场为驱动力，以毛细管作为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的一类液相分离技术[1]。CE作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离技术，自上世纪80年代问世以来，得到了迅速发展，其研究和应用涉及环境分析、药物分离、生化分析等几乎所有的分析领域，引起学术届，尤其是色谱界的广泛关注。这与它独特的优点是密不可分的:①高效（105TP/m-107TP/m）快速（几十秒至几于分钟）；②分离模式多,选择自由度大；③分析对象广,小到无机离子大至整个细胞,具有“万能”的分析功能和潜力；④操作可高度自动化；⑤样品与试剂消耗量小、运转费用低,无环境污染问题等等[2]。一.毛细管电泳—电化学发光分离检测技术一.1电化学发光及CE-ECL简介一.2CE-ECL的模式一.3CE-ECL技术的应用进展一.4小结一.1电化学发光及CE-ECL简介[3]电化学发光(ECL)是一种在电场的作用下，在电极表面将电能转化为辐射能的化学发光方法。在ECL体系中，三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)是最常用的发光试剂。近几年，Ru(bpy)32+技术已经成功应用于CE，简称CE-ECL。CE-ECL主要用来检测胺类化合物，并且成功用于各种实际样品的分析。它具有以下的优点：操作简单、灵敏度高、分离效率高、分析速度快以及试剂消耗少等。一.2CE-ECL的模式[3]CE-ECL主要有四种模式：•管区带电泳-ECL(CZE-ECL)•胶束电动色谱-ECL(MEKC-ECL)•毛细管电色谱-ECL(CEC-ECL)•非水毛细管电泳-ECL(NACE-ECL)其中CZE-ECL最简单，也最常见。一.3CE-ECL技术的应用进展•CE-ECL技术在药物分析方面的应用•CE-ECL技术对中药分析的应用•CE-ECL技术在生物体液及其生化方面的应用CE-ECL技术在药物分析方面的应用有实验[4]采用毛细管区带电泳吡啶钌电化学发光技术分析了药物中的比索洛尔。也有人发展了一种毛细管电泳电化学发光分析牛奶中乙基环丙沙星及其代谢产物环丙沙星的新方法。另有科学家将电化学发光检测方法和毛细管电泳联用技术用于动物分析,检测老鼠肝细胞中的抗坏血酸含量。毛细管电泳与电化学发光淬灭效应的间接检测也被用于酚类物质的研究。CE-ECL技术对中药分析的应用[4]CE-ECL技术被应用于对中药苦参中喹诺里西啶生物碱的分析及植物提取液中山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品的分析等。CE-ECL技术在生物体液及其生化方面的应用[4]有实验利用CE-ECL体系成功地分析了尿液中的雷尼替丁；发展了非水毛细管电泳电化学发光和电化学快速双检测分析叔胺新技术,用于实际尿液样品的分析；将毛细管电泳电化学发光联用技术用于四大环内酯类药物及其在人尿和片剂中药品的灵敏检测分析；采用液-液萃取技术,利用毛细管电泳分离-电化学与电化学发光双检测技术分析了尿液中的安非他明。一.4小结CE-ECL联用技术以及该技术在分析化学、生物分析化学等领域的应用取得了重要的进展。它可用于对具有化学发光响应的药物制剂及药物在生物体内的代谢物进行分析,为药物的分析提供灵敏的检测手段。今后对该技术的研究工作可能会围绕以下几方面展开:(1)共反应剂与吡啶钌电化学发光共反应机理研究。对共反应机理的进一步研究,有利于提高电化学发光的选择性和灵敏度,同时拓展该技术的应用范围。(2)新的电化学发光共反应剂的研究开发；(3)CE-ECL技术新应用。CE-ECL技术在众多领域的应用所带来的潜在价值,已引起了人们的广泛关注；(4)高通量CE-ECL分析体系的研究与开发。二.毛细管电泳-质谱联用技术二.1CE-MS技术简介二.2CE-MS接口技术的研究进展二.3CE-MS的应用及其进展二.4小结二.1CE-MS技术简介自1987年首次提出CE-MS联用方法以来,CE-MS作为具有高分离效率和高灵敏度的方法,其应用受到了广泛关注,并在过去的20年得到了迅速发展。CE的一些常用分离模式,如毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动色谱(MEKC)、毛细管电色谱(CEC)等,都在CE-MS中得到了应用。CE-MS联用分为在线联用和离线联用两种方式。CE-MS离线联用的关键是对已分离样品的有效收集;而且与离线联用相比,CE-MS在线联用具有样品损失少、自动化程度高、分析速度快等优点,其应用要比离线联用广泛得多。二.2CE-MS接口技术的研究进展接口技术是实现CE-MS联用的关键所在。近几年来,关于CE-MS方法学的研究主要是关于新接口技术。该技术的研究使得CE-MS的联用更加方便,效率更高。现主要分为：•CE-ESI-MS接口技术•CE-ICP-MS接口技术CE-ESI-MS接口技术ESI方法的发现使得被分析物带上多电荷后采用质谱仪可以检测相对分子质量达几万甚至十几万的生物大分子。由于ESI自身的优势以及LC-ESI-MS接口技术的日益趋于成熟,使得CE-ESI-MS已成为CE-MS联用技术中占主导地位的方法。目前CE-ESI-MS接口主要分为鞘液接口和无鞘液接口两种[7]。（1）鞘液接口技术鞘液接口技术的优点在于通过提高样品流速使得喷雾更加稳定,有利于形成稳定的电流回路,同时可改变CE运行缓冲液的组成,使其满足ESI源的检测要求。然而鞘液的引入会稀释样品,使检测灵敏度下降。为此,有人设计了低流速(lowflow)鞘液接口[5]（如图1），以降低鞘液的稀释作用,同时铂丝构成电流回路可以避免因流速低所造成的断流。最近,又出现了一种将鞘液接口和无鞘液接口相结合的技术[5]（如图2），这种设计既可以消除因鞘液造成的分离完整性的下降,又可以消除因无鞘液接口不能改变缓冲液而造成的磷酸根离子的离子抑制作用,综合了鞘液接口和无鞘液接口技术的优点。（2）无鞘液接口技术无鞘液接口技术不能像鞘液接口技术一样依靠稳定的喷雾实现电流回路,因此必须采用一些其他的方法来形成电流回路。（3）芯片CE-ESI-MS接口技术芯片CE与ESI-MS联用的方法主要分为两类:一类是将ESI源和CE微芯片整合在一起,另一类是把毛细管喷雾器附加在CE微芯片内。后者的应用更为广泛,其优势在于更有利于装置的微型化。CE-ICP-MS接口技术ICP-MS是一种先进的痕量多元素分析技术。CE-ICP-MS具有分离分析速度快、灵敏度高、分辨率高、样品用量少等优点,在金属及金属化合物的分离分析中扮演着重要的角色。迄今为止,主要有3种CE-ICP-MS接口技术:无鞘液接口技术、鞘液接口技术和氢化物发生接口技术。2008年Yang等[5]设计了一种新型的无鞘液接口(如图3所示),他们将毛细管装进一个不锈钢管套中,利用不锈钢管形成电流回路,管后连接一个蠕动泵1(图3中的部件1),再与一个三通接头相连,三通的另两个通路分别与蠕动泵2(图3中的部件2)和质谱检测器连接。这个设计的关键就在于蠕动泵1在不运行的情况下可以隔离雾化气和CE,这样雾化气的吸力作用便不会影响CE分离;而当蠕动泵1运行时,由于CE和不锈钢管之间有狭缝会吸入空气,吸入的空气不仅可以部分抵消雾化气的吸力作用,同时可以使溶液的传输更容易,从而克服了由于雾化气的吸力作用而造成的谱带展宽。二.3CE-MS的应用及其进展•生物大分子及相关物质分析•中草药及其他天然产物中活性和毒性成分分析生物大分子及相关物质分析蛋白质、糖类、脂类等生物大分子通常基质复杂、目标化合物含量低、纯化和分析检测较为困难。CE-MS联用技术作为高分离能力和高灵敏度的手段能够很好地解决生命物质的分析问题。（1）分离检测及结构功能分析CE-MS联用技术不仅可对蛋白质、多肽和脂类等生物大分子分离检测，也可进行不同生物分子构型的分析。CE-MS的应用有助于了解分子的结构功能信息,为分子的鉴定提供依据。（2）分子间相互作用研究及代谢组学研究目前,对于生物大分子及相关物质的研究已不仅仅局限于单个分子的结构功能,而是还要研究分子间相互作用以及代谢组学的问题,从而深入认识生命过程。在分子间相互作用研究方面,CE-MS在实现分离检测的同时,还可给出结构信息,为分子间加合物的研究提供了有力的手段。CE-MS在代谢组学方面的应用主要是血样或尿样中氨基酸、核苷等小分子图谱的分析,旨在从中筛选出生物标志物,为疾病的诊断和治疗提供依据[5]。（3）其它除了大分子代谢物的分析,CE-MS还被用于细菌提取物的分析。通过对细菌代谢组学的研究,可以认识细菌能量摄取和生长情况,从而为因细菌引起的疾病的治疗提供依据[5]。中草药及其他天然产物中活性和毒性成分分析中草药成分复杂,如何对其有效成分进行分析和质量控制一直是研究的难点。CE-MS除了在生命物质分析中起着重要的作用,在中草药分析中的应用也日益广泛[6]。•Henion等首次用CE-MS技术对几种草药中的多种异喹啉生物碱进行了分离，并用四氢小檗碱作内标，对小檗碱和巴马亭进行了定量分析。•Unger等对单萜吲哚生物碱(如氢化小檗碱、β-咔啉生物碱和异喹啉生物碱)进行了分析。•Sturm等分离了异喹啉类生物碱，对多种药用植物甲醇提取液中的异喹啉生物碱进行了鉴定。•Madteus等引用CE-ESI-MS分离分析了莨菪碱和莨菪胺，并用于实际样品的分析。•Armendia等则报道了采用CE-MS技术以负离子检测模式分析黄酮类化合物，在定量的同时对每种成分的结构进行了解析。二.4小结CE-MS联用技术大大拓宽了CE和MS本身的应用领域，但CE固有的缺陷并未克服[7]。对于CE-MS未来的发展趋势,主要仍将集中在提高CE的分离能力、新接口技术以及应用研究方面[5]。三.非水毛细管电泳毛细管区带电泳(CZE)既可以使用水相缓冲溶液，也可以使用有机相缓冲溶液进行分离。在有机溶剂中进行的CZE分离常被称为非水毛细管电泳(Nonaqueouscapillaryelectrophoresis，NACE)。三.1非水毛细管电泳的优势三.2NACE的检测方法三.3NACE中的富集方式三.4NACE在实际样品分析中的应用三.5小结三.1非水毛细管电泳的优势有机溶剂种类繁多，而且它们的物理化学性质各不相同。NACE可以针对被分析物的性质，选择不同的有机溶剂或混合有机溶剂。与水相CZE相比，NACE主要有以下优势[9]:•使用超大内径的毛细管柱•快速分析•降低吸附•提高分离选择性•有利于难溶于水及在水中不稳定的化合物的分离•对中性物质的分离•对手性物质的分离常见非水溶剂理化性质(1)使用超大内径毛细管柱在NACE中，由于离子对和供体-受体作用的存在，使得电解质的解离程度减小以及离子电导率降低，从而导致电泳电流减小，焦耳热降低。因此，可以使用超大内径的毛细管柱作为分离通道，从而提高样品的载量。在NACE中，所使用的毛细管柱的内径可达到530μm[5]。(2)快速分析在NACE中，分离高压所引起的电泳电流较小，因此可施加高的分离电压来进行快速的分析。有实验[9]将NACE用于人尿样中磷脂酰乙醇的快速分析。结果显示，在2.5min内就可实现此化合物的分析，分析速度比常规的色谱法提高了10倍。由于磷脂酰乙醇是一种乙醇摄入的生物标记物，可在乙醇存在的情况下，通过转磷脂酰反应在生物体内产生此外，它在生物体内的存留时间特别长。因此，可以通过检测磷脂酰乙醇来确定乙醇的摄入量。(3)降低吸附NACE能够降低表面活性剂的团聚以及在毛细管柱内表面的吸附，可用于一些阴离子和阳离子表面活性剂的分析。(4)提高分离选择性在NACE中，有很多有机溶剂可供选择，这些有机溶剂的介电常数、粘度及接受或提供质子的能力等物化性质与水相相比有很大差别。通过选择合适的有机溶剂或混合有机溶剂，NACE可以提高对被分析物的分离选择性。这是因为改变有机溶剂不仅可以改变被分析物的离子半径，而且还可以改变被分析物的pKa，