色谱概论

色谱分析法概论从二十世纪初起，特别是在近50年中，气相色谱法、高效液相色谱法及薄层扫描法得到了飞速发展，广泛用于各个领域，成为多组分混合物的最重要的分析方法，在各学科中起过和起着重要作用。色谱技术的由来1906年俄国植物学家Tsweet将碳酸钙放在竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。在管的不同部位形成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为固定相(stationaryphase)，冲洗剂称为流动相(mobilephase)。色谱领域的发展30年代：薄层色谱法40年代：纸色谱法50年代：气相色谱法(MartinandSynge)，达到“在线”（online）分析的新水平，奠定了现代色谱法的基础1956年：提出了开管柱色谱理论（Golay），次年诞生了毛细管色谱分析法60年代：气相色谱一质谱联用技术(GC－MS)，弥补了色谱法定性能力的弱点70年代：高效液相色谱法(HPLC)，用于难挥发、热不稳定及高分子产品分析，扩大了色谱法的应用范围，把色谱法又推进到一个新里程碑。薄层扫描仪，把薄层色谱法提高到“准在线”分离分析的新水平80年代初：出现了超临界流体色谱法(SFC)，兼有GC与HPLC的某些优点80年代末：高效毛细管电泳法(highperformancecapillaryelectro-phoresis，HPCE)理论塔板数可达107m1。用于生物大分子的分离色谱法分类1．按流动相与固定相的分子聚集状态分类•气相色谱法(gaschromatography，GC)•液相色谱法(liquidchromatography，LC)•超临界流体色谱法(supercriticalfluidchromatography，SFC)等按固定相分类气相色谱法气一固色谱法(GSC)气一液色谱法(GLC)液相色谱法液一固色谱法(LSC)液一液色谱法(LLC)。2．按操作形式分类•柱色谱法(columnchromatography)在将固定相装于柱管内构成的色谱柱内进行色谱过程填充柱(packedcolumn)色谱法毛细管柱(capillarycolumn)色谱法微填充柱(microborepackedcolumn)色谱法•平板色谱法(Planar或Planechromatography)在固定相构成的平面状层内进行色谱过程纸色谱法(paperchromatography薄层色谱法(thinlayerchromatography，TLC薄膜色谱法(thinfilmchromatography；将高分子固定相制成薄膜)•毛细管电泳法(capillaryelectrophoresis，CE)利用组分在电场作用下的迁移速度不同进行分离。3·按色谱过程的分离机制分类•分配色谱法(partitionchromatography)•吸附色谱法(adsorptionchromatography)•离子交换色谱法(ionexchangechromato-graphy，IEC)•空间排阻色谱法(stericexclusionchromato-graphy，SEC)•亲和色谱法(affinitychromatography)等第二节色谱法的基本原理一、色谱过程色谱过程是物质分子在相对运动的两相间反复分配“平衡”的过程。混合物中，若两个组分的分配系数(distributioncoefficient)不等，则产生差速迁移，而被分离流动相流动相固定相1234561234567891011121314151678910111213141516100110120130140150160170180190200如果样品在两相间的分配系数为1，进样1摩尔，样品“带”往前迁移100“塔板”后，第一个塔板中还剩余多少样品分子？每前进一格，第一块塔板中的样品量减少到1/2，前进100格后，样品量减至原来的2-10010-30进样时分子数为6.0231023个。所以样品带前进100个塔板后，第一块塔板中还剩6.02310-7个分子二、各基本类型色谱法的分离机制1．分配色谱法分配色谱法利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。其固定相为液体，GLC和LLC都属于分配色谱法范围在分配色谱中，溶于流动相与溶于固定相的溶质分子处于动态平衡，平衡时浓度之比(严格应为活度比)为狭义分配系数(partitioncoefficient)(式18·1)：溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质(种类与极性)有关；在GLC中K与固定相极性和柱温有关。smssmsVXVXCCK//2．吸附色谱法吸附色谱法利用被分离组分对固体表面活性吸附中心吸附能力的差别而实现分离。其固定相为固体吸附剂，大部分GSC和LSC都属于吸附色谱法。吸附过程是样品中各组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心(即为竞争吸附)的过程。吸附平衡可以表示为：Xm＋nYa＝X+nYm流动相中组分的分子Xm与吸附在吸附剂表面的n个流动相分子Ya相置换，组分的分子被吸附，以Xa表示。流动相分子回至流动相内部，以Ym表示。吸附平衡常数称为吸附系数(Ka)，可近似用浓度商表示：nnnKmmaaYXYX因为流动相的量很大，[Ym]n／[Ya]n近似于常数，且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附系数可写成：Ka=[Xa]／[Xm]=(Xa／Sa)／(Xm／Vm)式中Sa为吸附剂的表面积，Vm为流动相(展开剂)的体积。吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。3．离子交换色谱法离子交换色谱法利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。其固定相为离子交换树脂，按可交换离子的电荷符号又可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。3．离子交换色谱法离子交换色谱法利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。其固定相为离子交换树脂，按可交换离子的电荷符号又可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++前图中为树脂骨架，树脂表面的负离子(如SO3-)为不可交换离子；其正离子为可交换离子(H+离子)。当流动相中携带有正离子出现时，发生交换反应。交换反应达平衡时，以浓度表示的平衡常数称为选择系数(selectivitycoefficient；Ks)，即Ks=[RX+]／[X+](18·3)式中RX+为交换到树脂上的阳离子，X+为在流动相中的游离阳离子。Ks与离子的电荷和水合离子半径、流动相性质和pH、离子交换树脂的性质及温度有关。4．空间排阻色谱法空间排阻色谱法根据被分离组分分子的线团尺寸而进行分离。其固定相是多孔性填料凝胶，故此法又称为凝胶色谱法(gelchromato-graphy)，也称为分子排阻色谱法。•以有机溶剂为流动相者称为凝胶渗透色谱法(gelpermeationchromatography，GPC)；•以水溶液为流动相者为凝胶过滤色谱法(gelfiltrationchromatography，GFC)。凝胶色谱法的分离机制与前三种色谱法完全不同，它只取决于凝胶的孔径大小与被分离组分线团尺寸之间的关系，与流动相的性质无关。其作用类似于分子筛的作用(反筛子)，示意图见后。凝胶色谱法的分离机制有多种理论，空间排斥理论是目前被多数人所接受的理论。该理论有两条假设：(1)孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：Xm＝XsXm与Xs分别代表在流动相与凝胶孔隙中同等大小的溶质分子。平衡时，两者浓度之比为渗透系数(Permeationcoefficient；Kp)Kp=[Xs]／[Xm](18·4)(2)渗透系数的大小只由溶质分子的线团尺寸及凝胶孔隙的大小所决定。在凝胶孔径一定时：①当分子大到不能进入凝胶的所有孔隙时，[Xs]=0，则Kp=0；②当分子小到能进入所有孔隙时，[Xs]=[Xm]，则Kp=1；③分子尺寸在上述两种分子之间时，0Kp1。在高分子溶液中，相同成分的分子的线团尺寸与其分子量成比例。因此，在一定分子线团尺寸范围内，Kp与分子量相关。气相色谱法•分配色谱•吸附色谱液相色谱法•分配色谱•吸附色谱•离子交换色谱•凝胶色谱化学键合相色谱法(chemicallybonded－phasechromatography)，其分离机制是上述基本类型的组合，对于特定固定相在特定实验条件下，哪一种机制起主要作用仍是当前研究较多的问题。SiOCH3SiCH3C18H37ODS键合相三、分配系数与保留行为的关系1．分配系数达到分配“平衡”后，组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(C)之比为分配系数(K)。K与组分、固定相和流动相的性质及温度有关。(18·5)2．保留时间由进样到某组分色谱峰峰顶的时间间隔为该组分的保留时间(tR)，如第18张投影片所示。msCCK不保留(不溶于固定相或不被固定相所吸附等)组分的保留时间为死时间(t0)，亦即流动相的保留时间。保留时间是色谱法的基本定性参数，主要用于定距洗脱(定距展开)。所谓定距洗脱，即记录组分通过一定长度的色谱柱或色谱板的时间，如GC、HPLC及旋转薄层色谱法应用这种洗脱方式。记录组分在同一展开时间的迁移距离，称为定时洗脱(定时展开)。这种展开方式多用于薄层色谱法(见第19章)。3．保留时间与分配系数的关系设在单位时间内一个分子在流动相中出现的几率(即在流动相中停留的时间分数)为R’，则这个分子R’时间分量在流动相中，(1-R’)时间分量在固定相中。对于大量分子，则可表示有R’量的溶质分子在流动相，而(1R’)量的溶质分子在固定相。因为在流动相及固定相中溶质的量可分别用CmVm及CsVs表示，所以，msmmssVVKVCVCRR''1由于R’表示溶质分子在流动相中的几率，而溶质分子只有出现在流动相中时才能随着流动相移动。因此对保留特性为R’的溶质，则表示它在色谱柱中的移动速度将是流动相分子速度的1/R’。即溶质分子流经同样路程所需时间tR将1/R’倍于t0，即tR=t0/R’，所以：tR=t0(1+KVs／Vm)(18·6)msVVKR1'1tR=t0(1+KVs／Vm)叫色谱过程方程，是色谱法最基本公式之一，说明保留时间与分配系数的关系。由此式可见，在色谱柱(或薄层板)一定时，Vs与Vm一定；若流速、温度一定，则tR一定。这样tR取决于分配系数K，K大的组分tR长。K与组分、流动相和固定相的性质及温度有关。因此，在实验条件一定时，tR取决于组分的性质，因而tR可用于定性。上述四类基本类型色谱法的tR与K的关系皆可用式(18·6)描述。但K与Vs在不同色谱中含义不同。K的称呼（统称分配系数distributioncoefficient）：分配色谱：狭义分配系数K吸附色谱：吸附系数Ka离子交换色谱：选择系数Ks凝胶色谱法：渗透系数Kp。各系数可以不用下标，一律用K表示。Vs的称呼：分配色谱：色谱柱(或薄层板)中固定液体积吸附色谱：吸附剂表面积离子交换色谱：交换树脂的总交换容量凝胶色谱法：凝胶的孔容(凝胶孔内总容积)。4．分配系数不等是分离的前提设一个二组分A与B的混合物通过色谱柱，若二者能被分离，则它们的迁移速度必须不同(差速迁移)，即保留时间不等。根据式(18.6)：tR(B)＝t0(l+KBVs/Vm)①tR(A)＝t0(l+KAVs/Vm)②②①得:DtR=tR(A)tR(B)=t0(KAKB)(Vs/Vm)由上式可见，若使DtR0，必须使KAKA。即分配系数不等是分离的前提。因此必须选择适宜的分离条件，使得难分离组分的分配系数不等。两组分(A、B)混合物KA＞KB，因此B先于A流出色谱柱。当B随流动相进入检测器(将浓度变化转变为电信号变化的装置)时，流出曲线开始突起，随B在检测器中的浓度变化而形成色谱峰B。当B完全通过检测器后，流出曲线回复平直——基线（流动相造成的本底值）。而后，分配系数大的组分A进入检测器，形成色谱