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生物表面活性剂产生菌的分离与鉴定左豫虎，毕思宁，侯巨梅，刘铜（黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江大庆163319）摘要：采用富集培养、传代培养、血平板、油平板等方法从270份大庆油田的油土样中初步筛选出10株潜在的产生物表面活性剂菌株，通过进一步的排油法和乳化性能（E24）复筛获得一株产生生物表面活性剂的优良菌株。对该菌株的生理生化特征、菌体和菌落形态学特征分析，并结合16SrDNA测定，表明该菌株属于假单胞菌属（Pseudomonassp.），命名为假单胞杆菌BS1。关键词：应用微生物学；生物表面活性剂；血平板；乳化性能；假单胞杆菌属中图分类号：Q939.99;O647.2IsolationandIdentificationofMicrobeProducingBiosurfactantZuoYuhu,BiSining,HouJumei,LiuTong(CollegeofAgronomy,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,HeiLongJiangDaQing163319)Abstract:Tenisolateswereisolatedfrom270Daqingoil-contaminatedsoilsbyenrichmentculture,subculture,hemolyticactivityassayonbloodagarplates,hydrolyzingoilactivityonoilagarplates.Thenthefermentationofthefirstisolatedstrainsweresecondlysecreenedbyandtheemulsificationindex,Oneisolateaspotentialbiosurfactantproducerwasobtainedbydegreasingoilassayandtheemulsificationindex(E24).ThisisolatewasidentifiedasPseudomonasproducingbiosurfactantspBS1basedonitsphysiologicalcharacteristicsandanalysisofits16SrRNAsequence.Keywords:appliedmicrobiology;biosurfactant;hemolyticactivityassay;emulsificationindex;Pseudomonas0引言生物表面活性剂（Biosurfactant）是从生物来源分离得到的一类具有降低表面张力、稳定乳化、增加泡沫稳定性等表面特性的物质，通常有亲水基和亲油基两部分。生物表面活性剂的表面活性与化学合成的表面活性剂相当，但具有可生物降解的优点、对环境友好、相容性好、起泡性能强，甚至在极端的生存条件下仍能保持良好的选择性和专一性。因此在石油工业、环境工程、农业、食品药品等领域都显示出了独特的应用前景[1]。筛选产表面活性剂性能优良的菌株是获得和应用生物表面活性剂的关键步骤，因此本实验以大庆石油污染土壤为分离源，拟分离出产生物表面活性剂的菌株，并对其进行菌种鉴定，为进一步运用研究奠定基础。1材料与方法1.1土壤样品采集选择大庆90个有代表性的加油站或油井旁边进行土壤采样，其分布宜尽量照顾到大庆地区不同石油污染土壤。在确定的采样点上，先用小土铲去掉表层3cm左右的土壤，然后倾斜向下切取一片片的土壤，按需要的量装入袋中带回。每个采样点取3个土样，共270份土样，用牛皮纸袋装好，作好标签。基金项目：教育部高等学校博士点科研基金（200802230001)；黑龙江省教育厅基金(5040299310242)资助。作者简介：左豫虎，（1965-），男，教授，主要研究方向：应用微生学和植物病原真菌学与植物真菌病害.E-mail:zuoyhu@163.com1.2菌株筛选1.2.1富集培养将油土样按5%的接种量分别接种到富集培养基中[2]，于37℃、180r/min条件下振荡培养。1.2.2传代培养当富集培养液变浑浊后，按5%的接种量接种到传代培养基中（与富集培养相同），于37℃、180r/min条件下进行传代培养，直至菌株稳定。1.2.3油平板筛选将富集培养液划线接种于以原油为唯一碳源的油平板上[3]，于37℃保温保湿培养3~4d。只有产生表面活性剂能够乳化碳氢化合物的菌株才能吸收利用石油形成噬油斑，然后挑选出有噬油斑的菌落接种于斜面上，37℃条件下培养24h后，于4℃冰箱保存。1.2.4血平板筛选采用平板划线法将有噬油斑的菌落菌株接种于血平板上[4]，于37℃恒温培养箱中培养24~48h，然后挑选溶血圈大且透明的单菌落划线接种于斜面上，37℃条件下培养24h后，于4℃冰箱保存，作进一步复筛研究。1.2.5复筛用生物表面活性剂排油圈检测法进行，参照毕思宁等[5]方法。将1ml初筛获得菌株的发酵液用微量移液器加在含苏丹红Ⅲ石蜡平板上，测量排油圈直径。将排油圈直径大于6cm的菌株作乳化性能测定，乳化性能E24测定参照Copper方法[6]。1.3生理生化特征鉴定根据《伯杰士手册》和文献[7,8]中的生理生化测定方法对筛得的生物表面活性剂产生菌进行相关的生理生化特征鉴定。1.416SrDNA序列分析利用氯苯法[9]提取菌株总DNA，采用细菌16SrDNA通用引物（27F和1492R）进行PCR序列扩增。引物27F的序列为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（Escherichiacoliposition8－27）；1492R（Escherichiacoliposition1492－1510）的序列为：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反应体系为（25μL）：10×buffer2.5μL，dNTP（2.5mM）1μL，Mg2+（25mM）2μL，primer27F（10μM）1μL，primer1492R（10μM）1μL，模板DNA1μL，rTaqDNA聚合酶0.25μL（5unit/μL），加ddH2O补足至25μL。PCR反应程序为：94℃变性5min，92℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物送至上海生物工程技术有限公司测序。2结果与分析2.1生物表面活性剂产生菌的分离筛选从270份来自大庆不同地区的石油污染土样中，经富集培养、传代培养、血平板筛选和油平板筛选后共获得10株初筛菌株(图1和图2)。图1菌株在油平板上形成的噬油斑Fig.1Hydrolyzingoilspotofbiosurfactantfromstrainonoilagerplate图2菌株在血平板上形成的溶血斑Fig2Hemolyticzoneofbiosurfactantfromstrainonbloodagarplate10株菌株通过3次连续的摇瓶培养后，用排油圈法和乳化性能对菌株进行排油活性测定，获得表面活性稳定、排油直径6.4cm，乳化E24=41%的菌株1株(图3)，表明该菌株能产生表面活性物质，且表面活性物质的含量也比较高，具有进一步研究的价值。因此，选择该菌株进行以下更深入的研究。图3菌株发酵液排油效果Fig3Degreasingeffectoffermentationbroth2.2生物表面活性剂产生菌的生理生化鉴定筛选所得的产表面活性剂菌株革兰氏染色呈阴性。显微镜下观察，菌株为两端椭圆、大小0.6×2.2μm的细长杆菌。菌株在平板培养基上生长的菌落为不透明、乳白色、边缘整齐、向外延扩散的不规则圆形。菌株的生理生化特征如表1所示。根据菌株的生理生化特征鉴定结果，该菌株属假单胞菌属（Pseudomonassp.）。表1BS1菌株生理生化鉴定结果Table1Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrain生理生化鉴定项目特征生理生化鉴定项目特征甲基红（M.R.）试验+淀粉水解试验+V.P.试验-吲哚试验-过氧化氢酶活性+硫化氢试验+糖发酵试验硝酸盐还原试验+蔗糖+↑明胶水解试验+葡萄糖+注：“+”表示阳性;“–”表示阴性;“↑”表示产气2.316SrDNA序列分析测定编码核糖体小亚基（16SrDNA）的基因序列，是一种鉴定菌株的可靠方法。本试验采用氯苯法提取菌株总DNA，进行PCR序列扩增、PCR产物测序。将测序结果提交NCBI网站，序列提交GenBank（）的基因登录号为GQ281048。在NCBI网站上，对该序列进行BLAST检索，从GenBank核酸数据库中调取已注册的相关16SrDNA序列进行同源性比对，选取比对结果中同源性在95%以上的基因序列使用ClustaW和MEGA4.0软件进行多重序列比对，用Neighbor-Joining的方法构建系统进化树来确定其分类学地位。从系统进化树（图4）分析结果可知，筛选所得的产表面活性剂菌株与已报道的假单胞菌属菌株的亲源关系最近。结合生理生化特征、菌体和菌落形态学特征进一步确定该菌株在分类学地位上属于假单胞菌属（Pseudomonassp.），并根据GenBank系统产生的序列号，将该菌株命名为假单胞杆菌BS1。图4菌株的系统进化树Fig4Phylogenetictreeofstrain3结论自然界中产生物表面活性剂的微生物很多，比较常见的有假单胞菌[10]、地衣芽孢杆菌[11]和热带假丝酵母[12]等。本试验将多种筛选方法相结合使用，以大庆不同地区的石油污染土壤为分离源，对生物表面活性剂产生菌进行初筛和复筛，从而保证了所筛选菌株的全面性和准确性。试验筛选到1株噬油现象和溶血现象明显、排油圈直径大、乳化性能良好的生物表面活性剂产生菌，为今后开发和利用生物表面活性剂产生菌进行环境修复、农业病害防治、提高采油率等方面提供了较好的菌种资源。通过一系列的生理生化试验结果，参照常见细菌初步检索表和常见革兰氏染色阴性细菌检索表初步确定其属于假单胞菌属（Pseudomonassp.）。为了确保鉴定的准确性，对菌株进行了16SrDNA序列比对分析，进一步确定该生物表面活性剂产生菌在分类地位上属于假单胞菌属（Pseudomonassp.）。这为更加深入的了解其生长规律、生活特性，从而更加有效的对其进行开发和利用奠定了基础，但尚缺乏足够的证据将其分类地位确定到具体的菌种，对此还须进一步的研究证实。[参考文献](References)[1]PATTANATHUKSMR,EDWARDG.Production,CharacterisationandApplicationsofBiosurfactants-Review[J].Biotechnology,2008,7(2):360-370[2]李宝明，阮志勇，姜瑞波.石油降解菌的筛选、鉴定及菌群构建[J].中国土壤与肥料，2007,(3):68～72.[3]钱晓勇，刘国庆，宗凯，等.1株生物表面活性剂产生菌筛选及其条件优化[J].安徽农业科学，2009,37(13):5848～5850.[4]易霞.泽普油田生物表面活性剂产生菌的筛选[J].生物技术，2008,18(6):59～61.[5]毕思宁，王彦杰，左豫虎。生物表面活性剂排油圈检测方法的改进和应用[J].黑龙江八一农垦大学学报，2009,21(6):58～60.[6]COOPERDG,GOLDENBERGBG.SurfaceactiveagentsfromtoBacillusspecies[J].Appl.Environ.Microbiol.1987,53(2):224.[7]BuehananRE,GibbonsNE.Bergey,sManualofDeterminativeBaeteriology(8thed)[M].Baltimore:TheWoIliams&Wilkinseompany,1