生物化学第12章核酸的生物合成1xg

第十二章核酸的生物合成生物化学Part.112.1.0中心法则12.1DNA的生物合成病毒（复制）复制转录翻译逆转录DNARNA蛋白质1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。1964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录RNA的复制存在于RNA病毒DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。12.1.0中心法则复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。中心法则的几个基本概念中心法则图示Reversetranscription12.1.1DNA的半保留复制定义：以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。半保留复制的实验证据:1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。12.1DNA的生物合成DNA复制的可能方式DNA半保留复制图示半保留复制的证明Meselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。15N-DNA的密度＞14N-DNA的密度亲代DNA（15N～15N）子一代DNA（15N～14N）子二代DNA(15N～14N，14N～14N1:1)子三代DNA(15N～14N，14N～14N1:3)子四代DNA(15N～14N，14N～14N1:7)亲代DNA与子二代DNA的混合物亲代DNA与子四代DNA的混合物复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图DNA的半保留复制的生物学意义DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。12.1.2DNA复制的起点与方向复制中的DNA复制原点复制叉双向复制单向复制大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状）DNA复制的主要方式3不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）12.1.3原核细胞DNA的复制（DNA指导下DNA合成）DNA聚合酶催化的反应12.1.3原核细胞DNA的复制（DNA指导下DNA合成）12.1.3原核细胞DNA的复制（DNA指导下DNA合成）①DNA聚合酶Ⅰ1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶，含一个锌原子，为多功能酶：（1）53聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）；（2）35’外切酶活性（对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）；（3）还具有53’外切酶活性（双链有效）。DNA聚合酶Ⅰ的功能12.1.3原核细胞DNA的复制（DNA指导下DNA合成）ArthurKornberg1918StanfordUniversityStanford,CA,USATheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid12.1.3原核细胞DNA的复制（DNA指导下DNA合成）②DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅱ多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。12.1.3原核细胞DNA的复制（DNA指导下DNA合成）②DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅲ：多亚基酶，含十种亚基。（αβγθτδδ’χΨε），其中（αεθ）称为核心酶，β2称为夹子，（γ2δδ’χΨ）组成γ复合物，其主要功能是帮助β亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。因此认为该酶DNA的真正复制酶。DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成亚基相对分子量亚基数目基因亚基功能αεθτγδδ’χΨβ1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadX＊holAholBholCholDdnaN聚合作用3’→5’外切酶的校对功能组建核心酶使核心酶二聚化依赖DNA的ATP酶，形成γ复合物与β亚基结合，形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物形成γ复合物两个β亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力。DNA双螺旋DNA聚合酶Ⅲ的β-钳子俯视图大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ结构基因＊不同种类的亚基数目相对分子质量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持续合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修复PolB≥788,000＋－2,4001,500修复PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000复制③双链DNA复制的分子机制冈崎片段和半不连续复制前导链滞后链冈崎片段前导链：以3’→5’方向的亲代链为模板连续合成的子代链。滞后链：以5’→3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。半不连续复制的发现1968日本学者冈崎：同位素实验，用含3H的dT标记用T4噬菌体感染的大肠杆菌短时间内分离的DNA均为DNA小片段一段时间后检测到DNA大片段。当用DNA连接酶的缺失的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。→证明DNA复制中有小片段合成。测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于U替代dT渗入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，DNA的U不再被切除，则检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。冈崎片段的RNA引物原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3’-OH.合成方向：53DNA滞后链生成基本步骤：起始延长终止DNA连接酶DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。DNA连接酶作用机理与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)蛋白质功能相对分子量（×103）分子/细胞DNA旋转酶（或拓扑异构酶）引入或松开超螺旋400DNA解链酶使双链DNA解链6550单链结合蛋白稳定单链区74300引物合成酶合成RNA引物60100DNA聚合酶Ⅰ除去引物并填满缺口109300与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)1.拓扑异构酶拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)两类拓扑异构酶作用特点:拓扑异构酶І使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶Ⅱ使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。二者共同控制DNA的拓扑结构。与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)2.解螺旋酶（解链酶）通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。3.单链结合蛋白•稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)4.引物合成酶与引发前体引物合成酶：催化引物RNA的生成引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中)4.引物合成酶与引发前体引物合成酶：催化引物RNA的生成引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）1.复制的起始①起始复合物的形成：称为引发②RNA引物的合成2.链的延伸3.复制的终止复制原点及其识别DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用oriC(或o）表示。大肠杆菌的复制原点oriC由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。复制原点由DnaA蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π、SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。（一）复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。(二)链的延长（冈崎片段的合成）真核生物的冈崎片段为：100-200bp原核生物的冈崎片段为：1000-2000bpDNA链的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种5’-脱氧核苷