生物化学第12章核酸的生物合成2

第十二章核酸的生物合成生物化学Part.212.2RNA的生物合成12.2.1转录(DNA指导下的RNA合成)转录(transcription)：以DNA为模板，根据碱基配对的原则合成与DNA互补的RNA的过程。（一）转录与DNA复制的比较:相同相同点1.都需要模板2.都以三磷酸核苷酸为底物（NTP或dNTP）3.合成方向都是5→’3’（一）转录与DNA复制的比较:不同转录与DNA复制的不同点1.转录不需引物；2.只转录DNA分子中的一个片段（称为转录单位或操纵子,operon)；3.双链DNA中只有一条链具有转录活性（称为模板链）；4.哪个基因被转录与特定的时间、空间、生理状态有关。5.RNA聚合酶无校对功能。模板链：双链DNA中具有转录活性的的链称为模板链，又称反义链（或负链）。编码链：双链DNA中无转录活性的链称为编码链，又称有义链（或正链）。（二）原核细胞的转录大肠杆菌的RNA聚合酶：大肠杆菌的RNA聚合酶全酶由5种亚基α2ββ’σ组成，σ因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与β’βα2分离，没有σ、亚基的酶称为核心酶——只催化链的延长，对起始无作用。σ称为起始因子。（二）原核细胞的转录RNA聚合酶：四种核苷三磷酸（ATP、GTP、CTP、UTP）为底物；模板以双链状态下活性最大；聚合酶无校对功能；转录时双链局部解开，新生RNA链与模板链形成杂螺旋，转录结束后，DNA双螺旋恢复，RNA释放。大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的功能亚基基因Mr亚基数目功能αrpoA40,0002酶的装配，与启动子上游元件和活化因子结合βrpoB155,0001结合核苷酸底物，催化磷酸二酯键形成β’rpoC160,0001与模板结合σrpoD32,000–92,0001识别启动子，促进转录的起始9,0001未知（三）真核细胞的转录酶类分布产物α-鹅膏蕈碱分子量反应条件Ⅰ核仁rRNA5.8SrRNA18SrRNA28SrRNA对酶的作用不抑制500000~700000低离子强度,要求Mg2+或Mn2+Ⅱ核质mRNAsnRNA低浓度抑制~700000高离子强度Ⅲ核质tRNA5SrRNA高浓度抑制_高Mn2+浓度12.2.2大肠杆菌的转录过程1、识别阶段：RNA聚合酶在σ亚基的引导下结合于启动子上；2、DNA双链局部解开；3、起始阶段：在模板链上通过碱基配对合成最初RNA链；4、延伸阶段：核心酶向前移动，RNA链不断生长；5、终止阶段：RNA聚合酶到达终止子；6、RNA和RNA聚合酶从DNA上脱落。大肠杆菌的转录过程示意图之一大肠杆菌的转录过程示意图之二恢复螺旋转录泡编码链解螺旋模板链大肠杆菌的转录过程示意图之三12.2.3真核生物的转录过程1、首先TATA结合蛋白（TBP）结合于TATA盒，然后TFⅡB、TFⅡF、TFⅡE、polⅡ、TFⅡH也依次结合在启动子处形成闭合复合物；2、TFⅡH作用于起始子(Inr)位置开始解螺旋形成开放复合物；3、TFⅡH具有激酶活性，它将RNA聚合酶的C-端结构域的多个位点磷酸化，使起始复合物的构象改变而促进转录的起始阶段过渡进入延伸阶段。12.2.3真核生物的转录过程4、延长反应开始后，TFⅡE、TFⅡH释放；5、延长因子加入，与RNA聚合酶、TFⅡF形成延伸复合物，使RNA聚合酶的延长效率大大促进；6、RNA聚合酶的终止反应的机理尚不明确，反应终止后，RNA聚合酶脱磷酸化，并重新进入下一个循环，准备下一个转录的起始。TFⅡF除了参与转录外，还与DNA损伤的修复有关。12.2.4启动子与终止子启动子(promotor)：指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段特定的DNA序列。利用足迹法（footprint）和DNA测序法可以确定启动子的序列结构.足迹法即是将DNA起始转录的限制性片段分离后，用RNA聚合酶与之结合，再用DNA酶部分水解。与酶结合的部位被保护而不被水解，其余部分被水解成彼此只相差一个核苷酸的大小不等的片段，经凝胶电泳可测得酶结合部位的的序列结构。12.2.4启动子与终止子足迹法示意图大肠杆菌RNA聚合酶的启动子转录起始位-10区(pribnowbox)-35区大肠杆菌不同的σ因子识别不同启动子:s70forstandardpromoters;s32forheat-shockpromoters;s54fornitrogen-starvationpromotersStandardHeat-shockNitrogenstarvation图中所示：-35区是RNA聚合酶最先的结合部位，形成所谓“闭合复合物”，然后向下游移动至富含AT的-10区域，这是转录时开始解链的部位，此时形成“开放复合物”。①不依赖r-因子的终止子：含富GC的回文序列和寡聚U序列。②依赖r-因子的终止子的终止反应：r-因子：含六聚体的寡聚蛋白，具有依赖RNA的NTP酶活性，它结合于新生RNA上，借助与水解NTP产生能量推动RNA聚合酶向前移动，当酶遭遇终止子时暂停前进，r-因子追上酶，与酶相互作用释放RNA。还具有RNA-DNA解螺旋酶活性。③真核RNA聚合酶Ⅱ的启动子真核生物编码蛋白质的基因的启动子的一般特性真核RNA聚合酶Ⅱ需要许多其它蛋白因子真核RNA聚合酶Ⅱ和转录因子在启动子上的装配12.2.5RNA生物合成的抑制剂：①模板抑制剂烷化剂：使DNA发生烷基化，发生在G-N7，A-N1、N3N7；C-N1。易引起嘌呤的水解，在DNA上留下空隙干扰复制或转录；或引起碱基错配。放线菌素D：放线菌素D与DNA形成非共价的复合物，抑制其模板功能（低浓度抑制转录，较高浓度抑制复制）。具有类似作用的还有色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素。嵌入染料：可插入双链DNA分子相邻的碱基对之间，一般具有芳香族发色团。溴化乙锭（EB）是一种高灵敏的荧光试剂，常用来检测DNA和RNA。与DNA结合后抑制其复制和转录。12.2.5RNA生物合成的抑制剂：①模板抑制剂放线菌素D的结构与作用放线菌素D：模板抑制剂12.2.5RNA生物合成的抑制剂：②嘌呤和嘧啶类似物嘌呤和嘧啶类似物：人工合成的碱基类似物能够抑制和干扰核酸的合成。作为代谢拮抗物抑制合成酶类或直接掺到核酸分子中，形成异常RNA或DNA。12.2.5RNA生物合成的抑制剂：③RNA聚合酶抑制剂（1）利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶活性。利福平可以高效抑制结核杆菌，杀死麻疯杆菌，在体外有抗病毒作用。（2）利链霉素：与细菌RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中RNA链的延长反应。（3）-鹅膏蕈碱：抑制真核生物RNA聚合酶活性。12.2.6RNA转录后的加工①原核生物RNA的加工（1）mRNA前体的加工：原核生物的mRNA大多不需要加工，一经转录即可直接转译。但有少数多顺反子mRNA需要内切酶切成更小单位。如核糖体大亚基蛋白L10和L7/L12与RNA聚合酶的β-亚基和β’-亚基的基因共处一个转录单位，它在转录出多顺反子后切成两部分，一个是核糖体蛋白的三个mRNA共作为一个单位，共同翻译；另一个是RNA聚合酶的两亚基共处一个单位，共同翻译。细胞内RNA聚合酶的翻译水平远低于核糖体蛋白的翻译水平，将两者切开，有利于各自的翻译的调控。类似的加工在某些噬菌体中也很常见。12.2.6RNA转录后的加工①原核生物RNA的加工（2）rRNA前体的加工之一：6500个核苷酸甲基化核酸内切酶RNaseⅢ、P核酸外切酶12.2.6RNA转录后的加工①原核生物RNA的加工（2）rRNA前体的加工之二：StructureofE.coli30Spre-rRNA12.2.6RNA转录后的加工①原核生物RNA的加工（3）tRNA的加工之一：包括：核酸内切酶tRNA两端切断；核酸外切酶从两端向内切去多余序列：修剪；在3’-端加CCAOH序列;切除居间序列；核苷酸的修饰与异构化。12.2.6RNA转录后的加工①原核生物RNA的加工（3）tRNA的加工之二：12.2.6RNA转录后的加工②真核生物RNA的一般加工（1）mRNA前体的加工转录初始产物（hnRNA）12.2.6RNA转录后的加工②真核生物RNA的一般加工（2）真核mRNA前体的加工步骤:a.hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列）拼接上，真核生物一般为不连续基因。b.3’端添加polyA“尾巴”；c.5’端连接“帽子”结构（m7G5ppp5NmpNp-）；d.分子内部的核苷酸甲基化修饰。