铜II离子对生物废水处理系统中微生物的毒性

铜（II）离子对生物废水处理系统中微生物的毒性摘要铜是一种重要的元素，但是，这种重金属在相对较低的浓度下是微生物活性的抑制剂。这项研究的目的是评估铜（II）对废物处理过程中负责去除有机成分和营养物的各种微生物营养组的抑制作用。批次生物测定结果表明铜（II）对废水处理系统中的关键微生物群体造成了严重的抑制。发现反硝化细菌对铜（II）的存在非常敏感。引起50％抑制（IC50）的铜（II）对脱氮酶代谢活性的浓度为0.95mgL-1。铜对发酵细菌，需氧葡萄糖降解异养菌和硝化细菌也有抑制作用（IC50值分别为3.5,4.6和26.5mgL-1）。尽管如此，反硝化和硝化细菌在暴露于高铜水平（分别高达25和100mgCu（II）L-1）暴露仅几天后，其代谢活性显着恢复（分别用于脱氮和硝化）。恢复可能是由于可溶性铜的衰减或微生物的适应。一，简介重金属对环境，公众健康和经济的潜在影响一直是近几十年来的一个主要问题。铜，锌，镍和镉等重金属普遍存在于来自采矿，冶炼，半导体，冶金，电镀和金属加工行业。液体排放物中铜的浓度根据工业活动而显着不同。例如，塞尔维亚铜矿“Cerovo”采矿废水中的铜含量高达1550mgL-1（Stankovicetal。，2009）。铜在半导体出水中的浓度也很高，通常在5-100mgL-1范围内（Sierra-Alvarez等人，2007）。但是，市政废水中的铜含量预计会相当低，因为工业废水将被来自居民来源的废水稀释。另外，吸附和沉淀反应会导致生物废水处理系统中铜的去除。由Crane等人进行的研究（2010）报道了在不同类型的二级生物废水处理过程中大量去除铜。在加入高达40μgCuL-1的台架测定中，分别获得了99,84和47％的活性污泥，滴滤液和膜生物反应器的铜去除率。铜是所有生物体必不可少的元素（Burgess等，1999;Cervantes和GutierrezCorona，1994）;然而，这种重金属的高浓度抑制细胞代谢。含铜和铜的化合物被广泛用作杀菌剂和杀真菌剂。铜的抗菌作用被认为是铜离子螯合巯基的能力，从而与细胞蛋白质或酶相互作用（Yeager，1991）。已经进行了几项研究来确定废水处理过程中铜的微生物抑制潜力。铜对好氧异养细菌以及硫酸盐还原和其他厌氧降解过程中微生物的抑制作用已被广泛研究（Ahring和Westermann，1985;Jalali和Baldwin，2000;Karri2006;Lawrence和McCwq，1965;Mori等，2000;Mosey和Hughes，1975;Utgikar等，2001）。相比之下，关于这种金属对其他微生物群体在废水处理中起关键作用的毒性的信息是有限的，例如硝化和反硝化微生物和葡萄糖发酵细菌。据报道即使对于同一营养组中的微生物抑制其生物活性的铜（II）浓度差别也是很大。例如，在硫酸盐还原菌的研究中观察达到50％的铜（II）的抑制水平其浓度从仅0.84mgL-1至多达200mgL-1（Jalali和Baldwin，2000;Karri等人，2006;Sani等人，2001;Utgikar等人，2001）。在同样的方法中，厌氧污泥中产甲烷微生物的铜抑制水平发生了显着的变化，其数值从2.2mgL-1到400mgL-1几个数量级（Ahring和Westermann，1985;Karri等人，2006;Lawrence和McCwq，1965;Mori等人，2000;Mosey和Hughes，1975）。报道的铜在血管内水平观察到的显着变化很可能是由于在各种实验中使用的实验条件的差异（例如，培养基的组成，pH值，温度，铜配体浓度如硫化物，等），已知会影响铜的特性和生物利用度。本研究的目的是评估铜（II）对废水生物处理过程中涉及有机物和氮营养物质去除的各种微生物种群的毒性效应。为了比较不同微生物种群的抑制水平，所使用的毒性生物测定被设计为最小化实验变化（即pH值，微量元素溶液，温度，振荡条件在所有生物测定中相同）。2。材料和方法2.1。化学制品从SpectrumChemicalsandLaboratoryProducts（Gardena，CA，USA）获得硝酸钾和乙酸钠（N99.0％纯度）。从SigmaChemicalsCo.（St.Louis，MO，USA）购买脱水氯化铜（II）（99.0％ACS级），硫酸钠（N99.5％）和硫酸（95-98％ACS级）。碳酸氢铵由MPBiomedicals（Solon，OH，USA）获得。苯酚（99.0％ACS级）从EMDchemicals（Gibbstown，NJ，USA）获得。无水D-葡萄糖购自MallinckrodtChemical（Paris，KY，USA）。N2/CO2气体（80/20，v/v）由美国空气公司（美国亚利桑那州凤凰城）交付。所有的化学品都是按收到的使用2.2。污泥来源厌氧产甲烷颗粒污泥（Eerbeek和Aviko污泥）的两种类型在这项研究中进行了评估。Eerbeek污泥来自工业厌氧污泥床（UASB）再处理再循环废水（Industriewater，Eerbeek，TheNetherlands），以及来自UASB反应器处理污泥处理废水（Aviko，Steenderen，荷兰）的Aviko污泥。将两种接种物洗涤并筛分以除去细颗粒，并将其在4℃的氮气下储存。Eerbeek和Aviko污泥中挥发性悬浮固体（VSS）的含量分别为12.9％和11.5％。硝化试验中使用的接种物RandolphParksludgeI是从全面污水处理设施（RandolphParkWastewaterReclamationFacility，Tucson，AZ，USA）的硝化阶段获得的。污泥中的VSS含量为4.8％。分别使用Aviko颗粒污泥和RandolphParksludgeII在厌氧和好氧条件下获得葡萄糖降解富集培养物。富集培养物是通过将培养上清液以葡萄糖消耗以5％（v/v）的速率成功转移至含有新鲜葡萄糖的基础培养基中而形成的。好氧污泥，兰道夫公园污泥II（0.13％VSS），从兰道夫公园废水回收设施的曝气池获得。所有的污泥样品在4℃的氮气下储存。2.3。培养基在三元生物测定法（BM-1）中提供的基础矿物介质的组成为（mgL-1）：NaHCO3（2000），NaH2PO4·H2O（1200）和Na2HPO4（715）。包含（含L-1）：K2HPO4（250）的基础矿物介质在脱氮生物测定法（BM-2）（NH4）HCO3（417）和NaHCO3（1500）。用于好氧异养生物测定和发酵毒性生物测定（BM-3）的基础矿物介质包含（inmgL-1）：NH4Cl（280）;NaHCO3（2000）;K2HPO4（250）;KH2PO4（2050）;CaSO4·2H2O（10），MgSO4·7H2O（100）和酵母提取物（50）。所有培养基中添加10mgL-1酵母提取物和1mLL-1微量元素溶液（50），FeCl2·4H2O（2000），ZnCl2（50），MnCl2·4H2O（50），（NH4）6Mo7O24·4H2O（50），AlCl3·6H2O（200），CuCl2·2H2O（30），NaSeO3·5H2O（100），EDTA（1000），刃天青（200），CoCl2·6H2O和36％的HCl（1mLL-1）。所有培养基根据需要用HCl或NaOH调节至pH7.2。2.4。分批微生物毒性分析在各种毒性生物体中使用的实验条件总结在表1中。除非另有说明，批量生物测定使用补充有50ml培养基的玻璃血清烧瓶（165ml）进行。使用氯化铜（CuCl2·2H2O）的浓缩储备溶液加入所需量的铜（II）。在稀盐酸（10mM）中制备储备溶液以确保完全溶解铜。烧瓶缺乏铜也孵化和作为不受限制的控制。在厌氧和缺氧生物测定中，用丁基橡胶密封垫和铝制卷曲密封封口，然后用N2:CO2气体（80：20，v/v）冲洗顶部空间以确保无氧条件。好氧异养和氮化生物测定的顶空是大气，并且每天补充以防止氧的限制。在所有生物测定中，由于基础矿物介质的高缓冲能力，加入铜原液后的最终pH值约为7.2。硝化作用（mgNH4+-消耗的g-1VSSd-1），反硝化作用（mgNO3ˉg-1VSSd-1）和葡萄糖降解（mg葡萄糖降解的g-1VSSd-1）的最大活性由铵浓度，硝酸盐浓度和葡萄糖消耗;生物量浓度与时间（d），作三个平行重复测定的平均值计算得到。在每种情况下，在无铜对照显示最大特异活性的时间段内，确定给定铜浓度下的最大特异活性。观察到的抑制作用如下所示计算。与未抑制的对照相比，引起活性降低20,50和80％的铜（II）的初始浓度分别被称为IC20，IC50和IC80。这些值通过在绘制抑制剂浓度的作用所观察到的抑制作用（％）的图中插入来计算。除非另有说明，否则所报导的抑制浓度是三个平行相应标准偏差的平均值。2.5。分析方法使用Agilent7500a的电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）得到液体样品中的铜（II）浓度。分析系统的功率为1500W，等离子气体流量为15Lmin-1，载气流量为1.2Lmin-1。取样后立即用薄膜过滤（0.45μm），用稀硝酸稀释。如别处所述（Dubois等，1956），用比色法测定糖。简单地说，将0.5ml离心样品转移到试管中，然后加入0.5ml5％（v/v）苯酚和2.5ml浓硫酸。混匀样品并使其静置7分钟。随后，将管在45℃加热20分钟。使溶液冷却，并通过在490nm处测量样品的颜色强度来测定生物测定中的葡萄糖浓度。先前构建了含有范围从2.9到14.3mgL-1的葡萄糖浓度的校准曲线。用空白样品校正。使用Dionex3000系统（Sunnyvale，CA，USA），用DionexIonPacAS18分析柱（4×250mm）和AG18保护柱（4×40mm），通过抑制电导离子色谱分析硝酸盐和亚硝酸盐。该柱维持在35℃。使用的洗脱液为10mMKOH，流速为1.0mLmin-1。注射量为25μL。在测量之前，将所有样品离心（10,000rpm）10分钟或者通过膜滤器（0.45μm）。使用OrionThermo组合离子选择性电极测定铵。使用PerpHecTROSS玻璃组合电极以Orionmodel310PerpHecTpH-meter取样后立即测定pH。挥发性悬浮物和其他分析参数是根据“水和废水检测标准方法”（APHA，1998）确定的。3。结果与讨论图1显示了在0,1,2.5,5,10,25,35,50,80和100mg铜（II）L-1存在下硝化活性测定中来自氨的硝酸盐形成的时间进程的说明性实例。含有铜（II）的处理中的硝化活性基于不含铜的不受抑制的对照的活性进行标准化。图2A显示硝化微生物作为初始铜（II）浓度的函数的标准化活性。由对照最大硝酸盐形成时间计算其硝化活性，约90至180小时。本研究中其他微生物的生物活性用相同的方法计算。3.1。葡萄糖发酵菌铜（II）在极低浓度时对污泥中的厌氧葡萄糖发酵微生物具有抑制作用（表2）。观察厌氧培养物中铜浓度在0-10mgL-1范围内的葡萄糖利用率的显着降低（图3A）。厌氧富集培养和厌氧颗粒污泥（Aviko）对葡萄糖利用率产生50％抑制的铜（II）浓度分别为1.4和3.5mgL-1。这些结果表明，发酵微生物的生长在某种程度上与其代谢活性相比，更受铜（II）的影响。文献中铜对发酵菌的IC50值差异很大。Lin和Shei（2008）使用蔗糖评估了铜对发酵产氢产生的影响，发现在本研究中确定的IC50值与相同数量级（6.5mgL-1）的相同。两项研究铜对蔗糖产生H2的影响中（LiandFang，2007），一项来自乳品废水（YuandFang，2001）实验，IC50值高出一个数量级（分别为65和30mgL-1）。Zheng和Yu（2004）在评估铜对乳品废弃物转化为H2的影响的试验中发现，其IC50值（350mgL-1）相当高。在厌氧环境降解有机物其他微生物如产甲烷菌和硫酸盐还原菌相比发酵细菌似乎更容易受到铜的抑制作用，.IC50的可溶