硝基苯废水驯化过程中细菌群落结构的变化1

浙江大学学报(理学版)第37卷第1期JournalofZhejiangUniversity(ScienceEdition)VoIJ．37No．12010年1月http：／／．journals．zja．edu．cn／scian．2010DOI：10．3785／j．issn．1008—9497．2010．01．022硝基苯废水驯化过程中细菌群落结构的变化余彬彬，李钧敏。，金则新孙(1．杭州师范大学生命科学学院，浙江杭州310002；2．台州学院生态研究所，浙江临海317000)摘要：采用PCR—DGGE和RAPD分子标记技术分析了不同浓度硝基苯废水驯化的细茵群落结构变化，探讨硝基苯废水对细菌群落结构及多样性的影响．结果表明：RAPD分子标记显示不同浓度废水驯化的细茵群落的Nei’s指数(．I1)平均为0．2523，Shannon’s信息指数(J)平均为0．3730；而采用DGGE技术得到不同浓度废水驯化的细茵群落的h平均为0．2523，，平均为0．3958．RAPD分子标记分析可知当废水浓度从0增高至1O％时，多样性指数增加，而当浓度继续升高，多样性指数逐渐下降；DGGE方法分析发现当废水浓度从0升高至6O％时，多样性指数逐渐下降，但当废水浓度达到80％时，多样性指数比6O％时略有升高．基于DGGE数据分析获得的Shannon-Wiener多样性指数、Simpson多样性指教和丰富度指数与COD、C1一及硝基苯浓度之间均相关极显著，表明废水中所含的硝基苯、有机物及氯离子含量是引起细菌群落结构改变的主要原因．利用RAPD和DGGE两种方法得到的0同浓度硝基苯废水驯化的细菌群落相互之间的平均遗传距离分别为0．5717和0．4700．不同浓度硝基苯废水驯0获得的细菌群落可分为两大组，一组包括高浓度(60和8O)废水驯化细菌，另一组为低浓度(O、5、1O％、2O％和4O)废水驯化细菌．0键词：硝基苯废水；驯化；细菌群落结构；PCR—DGGE；RAPD中图分类号：X172文献标志码：A文章编号：1008—9497(2010)01—096—08YUBin-bin一，LIJun—min，JINZe-xin”(1．School0，LfeScience，HangzhouNormalUniversity，Hangzhou310002，China；2．InstituteofEcology，TaizhouUniversity，Linhai317000，ZhejiangProvince，China)Changeofbacterialcommunitystructureacclimatedbynitrobenzene-containingwastewater．JournalofZhejiangUniversity(ScienceEdition)，2010，37(1)：96—103Abstract：PCR—DGGEandRAPDmolecularmarkerswereusedtoanalyzethechangesofbacterialcommunitystruc-tureacclimatedbynitrobenzene-containingwastewaterinordertoexplorethemechanismhownitrobenzene-containingwastewaterinfluencebacterialcommunitiesstructureanddiversity．BasedonRAPDdata，Nei’sgenedi-versityindexaveraged0．2523andShannon’sin~ormationindexaveraged0．3730，whileNei’sgenediversityindexaveraged0。2523andShannon’sinformativeindexaveraged0．3958basedonDGGEdata．BasedonRAPDdata．thediversityincreasedwhentheconcentrationincreasedfrom0to10，andthendecreasedwhentheconcentrationincreasedfrom10to8O，ButbasedonDGGEdata，thediversityincreasedwhentheconcentrationincreasedfrom0to60andincreasedwhentheconcentrationincreasedto80％．Shannon—Wienerdiversityindex，SimpsondiversityindexandRichnessindexbasedonDGGEdatawasextremelysignificantcorrelatedwiththeconcentrationofC0D，C1一andnitrobenzene．indicatingthatdifferentconcentrationofCOD，C1，nitrobenzenemightbethemainfactorthatinducethechangesofbacterialcommunitystructure．Thegeneticdistanceamongbacteriacommunitiesacclimatedbydifferentconcentrationofnitrobenzene-containingwastewateraveraged0．5717and0．4700，respec—tively。whenRAPDandDGGEmethodswereused．Clusteringresultsshowedthatbacteriacommunitiesacclimatedby6Oand80wastewaterwereclusteredtogetherintoonegroupandtheotherbacteriacommunitiesacclimatedbylowcontentwastewater(O、5、1O、2O％and40％)wereclusteredtogetherintoanothergroup．KeyWords：nitrobenzene-containingwastewater；acclimation；bacterialcommunitiesstructure；PCR-DGGE；RAPD收稿日期：2009—03—10．基金项目：浙江省科技厅面上科技项目(2007C23052)．作者简介：余彬彬(1979一)，女，硕士研究生，主要从事微生物生态学研究*通信作者，教授，E-mail：[e-mail]．第1期余彬彬，等：硝基苯废水驯化过程中细菌群落结构的变化硝基苯是高毒性物质，具有三致(致畸、致癌和致突变)作用、难降解性和环境积累趋势，会严重威胁人类和其他生物的健康，已被列入“环境优先控制有毒有机污染物”名单[】]．硝基苯广泛用于染料、炸药、润滑剂、肥皂、苯胺和有机溶剂等的生产L2]，因此，化工废水中常含有高硝基苯．如何利用生物处理高硝基苯废水在生产实践中具有重要意义．活性污泥是一个由好氧的微生物所组成的复杂的生态系统[3]，其中细菌是主要的类群，它们个体小、数量多、更新快，在降解废水中的有机物质中起着关键作用．研究废水活性污泥处理系统中微生物的结构与多样性以及对废水中不同化学物质的响应是当前环境科学及环境工程领域研究的热点．目前，大多数的研究集中于分析活性污泥反应池中微生物结构与多样性的变化，此外，还探讨了活性污泥微生物结构与多样性对环境因子(如温度)或是化学物质(如废水COD)的响应[4]，但至今尚未见关于有机污染物或是实际废水对活性污泥中微生物结构与多样性变化的研究．phoresis，DGGE)[9_1、末端限制性片段长度多态性(terminal—restrictionfragmentlengthpolymor—phism，T—RFLP)[¨-1引、16SrDNA序列分析[等．其中RAPD分子标记技术由于具有操作简单快捷、成本低、通用性好、灵敏度高而且不需预先了解基因组的相关分子生物学信息等优点，近几年被广泛应用于微生物群落多样性研究[7卜¨]．DGGE的主要电泳条件都由微处理器控制，具有加样量小，重复性好，操作简便、快速等优点，广泛应用于活性0泥微生物多样性与结构的分析[9¨．0文以活性污泥细菌群落为研究对象，在实验室采用不同浓度硝基苯废水驯化细菌，利用RAPD和PCR—DGGE技术研究不同驯化阶段的细菌群落结构与多样性，分析其与硝基苯及COD的相关性，探讨硝基苯废水对细菌群落结构及多样性的影响，为硝基苯废水处理工艺的建立提供理论依据．1材料与方法分子生物学技术较多地应用于活性污泥微生物1．1材料结构与多样性的研究[6]，如随机扩增多态DNA活性污泥来自浙江台州某化工厂二沉池中的活(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)L卜、变性污泥．硝基苯废水取自浙江台州某化工厂原水，其性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectro—水质指标见表1．用NaOH调节pH至7．0，待用．表1硝基苯废水水质指标Table1Qualityindicesofnitr0benzene_c0ntainingwastewater1．2方法表2不同浓度硝基苯废水C0、C1一及硝基苯含量1．2．1活性污泥细菌的富集Table2TheconcentrationofCODc、C1一andnitrobenzene将活性污泥按10％(体积分数，全文同)的接种ofnitrobenzene-containingwastewater量加入到LB液体培养基中，150r·rain_。，30℃培养48h，待用．1．2．2活性污泥细菌的驯化取富集培养的细菌按10的接种量依次接入OO00含不同浓度硝基苯废水的LB液体培养基中，150r·rain_。，3O℃培养48h．分别转接6次至OD。0．2，每次转接的废水浓度分别为5、10、20％、40、6O％和8O，LB液体培养基中相应的COD、Cl一及硝基苯含量见表2．54860334．573．51097206691472O1944013382944O3888026765886O583204O148828O777605352117698浙江大学学报(理学版)第37卷1．2．3细菌基因组DNA的提取用降落式(Touch—down)PCR扩增程序为：94℃预12000r·min离心2min收集菌体，细菌基变性5min，94℃变性1rain，42℃退火1min(每因组DNA的提取采用CATB-溶菌酶一蛋白酶K隔1个循环下降0．5℃)，72℃延伸1．5min，共lO法[1．DNA在0．8琼脂糖凝胶上电泳后，置于上个循环；94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延海天能GIS凝胶成像分析系统(上海天能科技服务伸1．5min，共2O个循环；72℃完全延伸5rain．有限公司)中拍照保存，与标准DNA分子量参照比扩增产物在1．6的琼脂糖凝胶(含0．5g·较进行定量，并稀释成终浓度为20ng·L～，L溴化乙锭)中电泳，电泳缓冲液为0．5×TBE，20℃保存备用．电压为80V，电泳时间为2h．用GIS凝胶成像分析1．2．4细菌群落结构的PCR—DGGE分析系统(上海天能科技服务公司)拍照保存，用200bp采用对大多数细菌的16SrDNA基因V3区具DNAladder(上海华美生物工程公司)做标准分子有特异性的引物对：F338-GC(5-CGCCCGCCGCG量参照物．阴性对照加入除模板DNA外的以上各CGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGAC成分，用双蒸水代替总DNA．TCCTACGGGAGGCAGCAG一3)和R518(5一ATT采用l0碱基随机引物对驯化后的活性污泥细ACCGCGGCTCGTGG一3)进行PCR扩增．菌进行RAPD扩