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浙江大学学报(农业与生命科学版３５(５:４７３～４８１,２００９JournalofZhejiangUniversity(Agric畅&LifeSci畅文章编号:１００８‐９２０９(２００９０５‐０４７３‐０９DOI:１０.３７８５/j.issn.１００８‐９２０９.２００９.０５.００１收稿日期:２００８‐０８‐１２基金项目:国家自然科学基金资助项目(３０７７００３９;国家高技术研究发展计划８６３资助项目(２００６AA０６Z３３２.作者简介:郑平(１９６２—,男,浙江金华人,教授,从事废物生物处理研究.Tel:０５７１‐８６９７１７０９;E‐mail:pzheng＠zju.edu.cn.厌氧氨氧化菌的特性与分类郑平,张蕾(浙江大学环境与资源学院环境与工程系,浙江杭州３１００２９摘要:厌氧氨氧化是环境领域和微生物领域的一个重大发现,对于认识氮素生物地球化学循环、丰富微生物学理论和开发新型生物脱氮工艺均具有巨大的推动作用.近年来对厌氧氨氧化菌的研究取得了许多突破性成果,探明了个体形态特征、细胞化学组分特征、富集培养与分离特征、生理生化特征以及生态学特征,提出了厌氧氨氧化代谢模型,纯化研究了多种厌氧氨氧化酶,分离获得和分类鉴定了５属９种厌氧氨氧化菌,建立了厌氧氨氧化菌科(Anammoxaceae.本文系统介绍了厌氧氨氧化菌的特性,详细描述了９种已被鉴定的厌氧氨氧化菌.关键词:厌氧氨氧化菌;形态;生理;生化;种类中图分类号:Q９３９.９;X５３文献标志码:AZHENGPing,ZHANGLei（DepartmentofEnvironmentalEngineering,CollegeofEnvironmentalandResourceSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China）Characterizationandclassificationofanaerobicammoniumoxidation(anammoxbacteria.JournalofZhejiangUniversity(Agric畅&LifeSci畅,２００９,３５(５:４７３‐４８１Abstract:Anaerobicammoniumoxidation(anammoxisoneofimportantdiscoveriesinbothenvironmentalandmicrobiologicalfields.Itsupplementsbiogeochemistryofnitrogencycleinnature,extendsmicrobialdiversityandurgesdevelopmentofnovelnitrogenremovalbiotechnology.Recently,plentybreakthroughshavebeenmadeintheresearchofanammoxbacteria.Theirpropertiesinbacterialmorphology,cytochemistry,enrichmentandisolation,physiologyandbiochemistry,ecologywererevealed,andprobablemetabolicmodelswereproposed,andtheimportantenzymeswerepurifiedandcharacterized.AfamilyofAnammoxaceaeincludingfivegenus,ninespecieshasbeenestablished.Thispaperisasystematicreviewinthefeaturesofanammoxbacteriaandthenineidentifiedspecies.Keywords:anammoxbacteria;morphology;physiology;biochemistry;species在厌氧条件下,以亚硝酸盐作为氧化剂将氨氧化成氮气的生物反应称为厌氧氨氧化[１].１９９５年,由荷兰Mulder等[２]首先在一个处理酵母废水的反硝化中试装置内发现该反应过程.此后,人们陆续在海洋、河流、湖泊底泥等自然环境中检测出厌氧氨氧化反应,并认为它在氮素生物地球化学循环中起着举足轻重的作用.据估计,其氮气产量占海洋氮气释放量的３０％～５０％[３‐４].在环境工程上,厌氧氨氧化反应已成功地应用于废水生物脱氮处理.据报道,在荷兰鹿特丹污水处理厂,利用厌氧氨氧化工艺对污泥压滤液进行脱氮处理,反应器总氮去除率高达９.５kg爛m－３爛d－１[５],显示了诱人的应用前景.厌氧氨氧化的推动者———厌氧氨氧化菌是一群分支很深的浮霉状菌,其特殊的细胞结构、代谢方式和进化地位引起了生物学家的高度关注.本文拟就厌氧氨氧化菌的研究进展作一综述.１厌氧氨氧化菌的特性1畅1个体形态特征cw:细胞壁;cm:细胞膜;pa:外室细胞质;icm:胞质内膜;ri:核糖细胞质;am:厌氧氨氧化体膜;a:厌氧氨氧化体.长箭头:管状结构;短箭头:电子密集颗粒.图1厌氧氨氧化菌细胞的超微结构图Fig.１Ultrastructureofanammoxbacterialcell厌氧氨氧化菌形态多样,呈球形、卵形等,直径０畅８～１畅１μm[６].厌氧氨氧化菌是革兰氏阴性菌.细胞外无荚膜.细胞壁表面有火山口状结构[７],少数有菌毛[６].细胞内分隔成３部分:厌氧氨氧化体(anammoxosome、核糖细胞质(riboplasm及外室细胞质(paryphoplasm.核糖细胞质中含有核糖体和拟核,大部分DNA存在于此[８].该菌出芽生殖.厌氧氨氧化体是厌氧氨氧化菌所特有的结构,占细胞体积的５０％～８０％,厌氧氨氧化反应在其内进行[６].厌氧氨氧化体由双层膜包围,该膜深深陷入厌氧氨氧化体内部[９](图１.厌氧氨氧化体不含核糖体,但含六角形的管状结构和电子密集颗粒.透射电镜及能谱仪分析表明,这些电子密集颗粒中含有铁元素[９].1畅2细胞壁和细胞膜化学组分特征厌氧氨氧化菌的细胞壁主要由蛋白质组成,不含肽聚糖.细胞膜中含有特殊的阶梯烷膜脂,由多个环丁烷组合而成,形状类似阶梯[１０].在各种厌氧氨氧化菌中,阶梯烷膜脂的含量基本相似.疏水的阶梯烷膜脂与亲水的胆碱磷酸、乙醇胺磷酸或甘油磷酸结合形成磷脂,构成细胞膜的骨架.细胞膜中的非阶梯烷膜脂由直链脂肪酸、支链脂肪酸、单饱和脂肪酸和三萜系化合物组成.三萜系化合物包括C２７的藿烷类化合物(hopanoid,细菌藿四醇(bacteriohopanetetrol,BHT和鲨烯(squalene,C３０H５０.其中,BHT首次发现于严格厌氧菌中[１１].在不同厌氧氨氧化菌种中,非阶梯烷膜脂的种类和含量变化较大[１２].曾一度认为阶梯烷膜脂只存在于厌氧氨氧化体的双层膜上,其功能是限制有毒中间产物的扩散.目前认为阶梯烷膜脂存在于厌氧氨氧化菌的所有膜结构上(包括细胞质膜,它们与非阶梯烷膜脂相结合,以确保其他膜结构的穿透性好于厌氧氨氧化体膜[１０,１２].1畅3富集培养与分离特征厌氧氨氧化菌的富集培养选用自然样品作为接种物(如活性污泥、海洋底泥、土壤,按目标菌群所需的最佳生境条件,以含有适量基质和营养元素的培养液(表１在生物反应器中进行[７].厌氧氨氧化菌生长缓慢,倍增时间１０～３０d[８].富集培养物呈红色,性状粘稠,含有较多的胞外多聚物[１３].厌氧氨氧化菌是一种难培养的微生物,采用系列稀释分离、平板划线分离、显微单细胞分离等传统微生物分离方法,均未分离成功.迄今为止,密度梯度离心法是成功分离厌氧氨氧化菌的唯一方法.其原理是通过离心使不同密度的细菌细胞形成不同的沉降带[１４].具体操作方法如下:首先,用超声波温和破碎厌氧氨氧化菌富集培养物,将菌群分散成单个细胞;接着,离心去除残留的聚集体(生物膜或絮体碎片;最后,将分散的细胞用Percoll密度梯度离心,使厌氧氨氧化菌在离心管内形成一条深红色条带.采用该方法可获得高纯度的细胞悬液,每２００～８００个细胞中可只含有１个污染细胞[１５].表1富集厌氧氨氧化菌的营养元素组成Table１Nutrientsusedforanammoxbacteriaenrichment营养物质量浓度/(g爛L－１KH２PO４０畅０２７CaCl２０畅１８MgSO４爛７H２O０畅３KHCO３０畅５微量元素溶液ⅠEDTA５FeSO４５微量元素溶液ⅡEDTA１５H３BO４０畅０１４MnCl２爛４H２O０畅９９CuSO４爛５H２O０畅２５ZnSO４爛７H２O０畅４３NiCl２爛６H２O０畅１９NaMoO４爛２H２O０畅２２NaSeO４爛１０H２O０畅２１1畅4生理生化特征厌氧氨氧化菌为化能自养型细菌[７],以二氧化碳作为唯一碳源,通过将亚硝酸氧化成硝酸来获得能量,并通过乙酰‐CoA途径同化二氧化碳[１６].虽然有的厌氧氨氧化菌能够转化丙酸、乙酸等有机物质,但它们不能将其用作碳源[１７‐１８].厌氧氨氧化菌对氧敏感,只能在氧分压低于５％氧饱和(以空气中的氧浓度为１００％的条件下生存,一旦氧分压超过１８％氧饱和,其活性即受抑制,但该抑制是可逆的[１９‐２０].厌氧氨氧化菌的最佳生长pH范围为６畅７～８畅３,最佳生长温度范围为２０～４３℃[７].厌氧氨氧化菌对氨和亚硝酸的亲和力常数都低于１×１０－４gN爛L－１[１９].基质浓度过高会抑制厌氧氨氧化菌活性[１９,２１](表２.表2基质对厌氧氨氧化菌的抑制浓度Table２Inhibitionconcentrationsofnitrogenoussubstratesonanammoxbacteriammol爛L－１基质抑制浓度半抑制浓度NH４＋‐N７０５５NO２－‐N７２５注:半抑制浓度代表抑制５０％厌氧氨氧化活性的基质浓度.１９９７年,vandeGraff等[２２]基于１５N示踪研究,提出了厌氧氨氧化菌代谢模型(图２;基于厌氧氨氧化菌基因组学和酶学研究,其他研究者[２３,６]对此代谢模型作了修正(图３.２种模型的最大区别在于:前者认为亚硝酸的还原产物是羟氨(NH２OH,后者则认为亚硝酸的还原产物是NO.根据改进的模型,亚硝酸先被含有细胞色素c(CytC和细胞色素d１的亚硝酸还原酶(NiR还原成一氧化氮(NO２－＋e－NO;再由联氨水解酶(HH将一氧化氮与氨结合成联氨(NO＋NH４＋＋３e－N２H４;最后由联氨氧化酶(HZO或羟氨氧化还原酶(HAO将联氨氧化成氮气(N２H４N２＋４e－.在联氨氧化成氮气的过程中,可产生４个电子,这４个电子通过细胞色素c、泛醌、细胞色素bc１复合体以及其他细胞色素c传递给NiR和HH,其中３个电子传递给NiR,１个电子传递给HH.伴随电子传递,质子被排放至厌氧氨氧化体膜外侧,在该膜两侧形成质子梯度,驱动ATP合成[２３‐２８].图2基于15N示踪研究的代谢途径Fig.２Metabolicpathwaybasedon１５NstudyHAO和HZO是厌氧氨氧化菌中研究的较为深入的２种酶.HAO广泛存在于好氧氨氧化细菌、反硝化细菌等微生物中,它不但能够催化羟氨氧化成亚硝酸,也能够将亚硝酸还原为羟氨,还能催化氧化联氨[１].从厌氧氨氧化菌中分离获得的HAO不同于从好氧氨氧化细菌中获得的HAO,它不能将羟氨转化成亚硝酸,只能将其转化成NO或N２O.已被纯化的HAO有２种,虽然两者的分子量和亚单位不同,但是均含大量c型血红素[１６个和(２６±４个]和P４６８细胞色素.该酶也能催化氧化联氨,浙江大学学报(农业与生命科学版但对羟氨的亲和力更强[２４,２６](表３.HZO也已从厌氧氨氧化菌中分离纯化,它只能催化氧化联氨,不能催化氧化羟氨.但羟氨能与该酶结合,从而对联氨产生竞争性抑制[２５].图3基于基因组学和酶学的代谢途径Fig.３Metabolicpathwaybasedongenomicsandenzymology表3厌氧氨氧化菌HAO和HZO酶的特性Table３CharacteristicsofHAOan