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一株沼泽红假单胞菌VOTO1-G的分离鉴定及应用研究摘要:目的分离、筛选去除富营养化水体营养盐的高效菌株。方法采用富集、培养常规细菌分离方法，经过多次分离纯化，从河流沉积物中筛选出1株光合细菌菌株，命名为VOTO1-G。在研究其生长规律的基础上，采用分子生物学方法对该菌株进行了鉴定。将分离纯化的光合细菌富集培养后进行除污试验，探讨其不同浓度的除污效果。结果通过形态学、革兰染色、并结合16SrDNA序列同源性分析，其鉴定结果为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。通过对该菌株在培养过程中吸光度的测定，进一步研究了其生长规律:在5～10天，活菌数迅速增加，处于对数生长期，在10～14天，处于稳定期。利用不同投加量的沼泽红假单胞菌对富营养化河流水体进行处理研究，筛选的菌株具有一定的脱氮除磷、去除有机物的能力。COD、TP、TN的去除率分别为12%、25%、13%。结论从河流沉积物中分离出的沼泽红假单胞菌具有一定的脱氮除磷、去除有机物的能力。关键词:光合细菌沼泽红假单胞菌富营养化河流沉积物景观水体PhotosyntheticbacteriaofRhodopseudomonaspalustrisisolatedfromriversedimentAbstract:ObjectiveOnestrainofphotosyntheticbacteriaassociatedwithhighlyremovalcapabilityofpollutantwasisolated，andinvestigatedaboutitsgrowth．MethodsByusinganenrichmentcultureandplatedilutionmethod，onestrainofbacteria，namedVOTO1-G，wasisolatedfromriversedimentmainlyreceiveddomesticwastewater．TheVOTO1-Gbacteriawasresearchedaboutitsgrowthlaw，andidentifiedbymolecularbiologymethod，andfurtherusedtotestitsabilityintheremovingofnitrogen，phosphorusandorganiccompoundfromeutrophicwaterby0.05‰，0.1‰and0.2‰．ResultsBycheckingtheindividualmorphology，colonyculturecharacteristics，DNAsequencingand16SrDNAgenebank，VOTO1-GwasidentifiedasRhodopseudomonaspalustris．Theisolatedbacteriastrainhadsomenitrogen，phosphorusandorganiccompoundremovalability．ConclusionOnestrainofphotosyntheticbacteriawassuccessfullyisolatedfromsewagesediments．Itsremovalcapacityofnitrogen，phosphorusandorganiccompoundfromeutrophicwaterwasgood，whichremovedCOD12%，TP25%，TN13%．Keywords:photosyntheticbacteria，Rhodopseudomonaspalustris，eutrophication，riversediment，eutrophicwater第6期王琳，等.一株沼泽红假单胞菌VOTO1-G的分离鉴定及应用研究939近年来，国内外关于光合细菌去除水体中营养物质的报道很多［1-5］，主要集中在发展生物脱氮除磷的新工艺和新概念［6-7］、菌株选育［8-10］等方面。在菌种的选育方面，虽然已经发现了多种不同类型的光合细菌，但是不同光合细菌的脱氮除磷能力不同。如何获得高效的降解菌株以及如何使其成为反应体系中的优势种群而发挥更好的脱氮除磷效果仍然是研究的热点。本试验从受纳生活污水的河流沉积物中分离、筛选光合细菌高效降解菌株，并采用形态学特征、分子生物学等多种方法进行鉴定，为研究其在富营养化水体中的脱氮除磷性能和相关污水的处理提供微生物基础。1材料与方法1.1富集培养北京市清河主要是生活污水的受纳水体，氮、磷含量很高，其中总氮浓度(TN)为9.46mg/L(以N计)，总磷浓度(TP)为0.96mg/L(以P计)。取清河的底泥100g装入透明的玻璃圆桶标本缸内，与1000ml光合细菌液体富集培养基搅拌均匀，然后在标本缸上层加入液体石蜡以隔绝空气，在(25～35)℃下，以4000lx光照强度培养2周。用无菌滴管从光合细菌生长良好的圆桶玻璃标本缸内壁处，吸取红色细菌和污水水样5ml，移植到无菌试剂瓶中，加入灭菌后的富集培养液，加上橡皮塞，造成厌氧状态，继续光照，厌氧培养时保持(25～35)℃，试剂瓶中菌液的颜色逐渐变红。待生长良好后，再按上述同样步骤转接3次，至试剂瓶中菌液成棕红色，红螺菌科细菌占优势。红螺菌科分离培养基:NH4Cl0.1g，MgCl20.02g，酵母膏0.01g，K2HPO40.05g，NaCl0.2g，琼脂2g，蒸馏水90ml，0.1MPa灭菌20min。灭菌后，无菌操作加入经过滤除菌的0.5g/5mlNaHCO3;再无菌加入过滤除菌的0.1gNa2S·9H2O;最后再加5ml经过除菌的4%丙氨酸。用过滤灭菌的0.1mol/LH3PO4调pH至7.0。红螺菌科富集培养基:NH4Cl0.1g，NaHCO3(5%NaHCO3水溶液，过滤除菌取2ml加入无菌培养基中)0.1g，K2HPO40.02g，CH3COONa0.1g，MgSO4·7H2O0.02g，NaCl0.05g，生长因子(维生素B10.001mg、尼克丁酸0.1mg、对氨基苯甲酸0.1mg、生物素0.001mg，以上药品溶于蒸馏水中，定容至10ml，然后过滤除菌)1ml，蒸馏水97ml，微量元素溶液(FeCl3·6H2O5mg、CuSO4·5H2O0.05mg、H3BO41mg、MnCl2·4H2O0.05mg、ZnSO4·7H2O1mg、Co(NO3)2·6H2O0.5mg，以上药品分别溶于蒸馏水中，并定容至1000ml)1ml，pH7.0［11］。除NaHCO3、生长因子和微量元素溶液外，各成分溶解后0.1MPa灭菌20min，然后再分别加入NaHCO3、生长因子和微量元素溶液。1.2分离纯化分离用固体培养基:在液体培养基中加入2%的琼脂，其他成分不变。将已融化并冷却至(45～50)℃红螺菌分离培养基倾倒平板;再用已经过过滤除菌的0.05%抗坏血酸溶液对富集培养的红螺菌科细菌菌悬液适当稀释;以涂布分离法将稀释的红螺菌科细菌菌悬液在平板上，然后再倒入(45～50)℃红螺菌分离培养基，造成厌氧环境，(25～35)℃，4000lx光照下培养。待棕红色菌落出现后，挑单菌落在2ml液体富集培养基中进行扩增培养。重复上述操作，反复进行涂平板挑单菌落，直至获得纯菌种。同时保存纯菌种:(1)液态保存:将液体培养基灭菌后接入菌种，经光照培养后，置于4℃冰箱中，以后每隔30天转接一次;(2)固态保存:制备固体培养基，挑取较大的菌落穿刺接种，经光照培养后用液体石蜡封口，用黑布包裹后，置于－70℃下，每隔一年转接一次［12］。1.3菌种的生长规律试验在菌种筛选试验的基础上，对获得的菌种进行细胞生长测定及其生长规律的试验研究。在光合细菌的富集培养基中按20%的接种量接种，在30℃光照培养箱中培养，每天同一时间取3个重复于波长600nm处，测其吸光度(A值)，以便将菌体培养到对数生长期的初期或在对数生长期到稳定期之间。1.4菌种的鉴定对所筛选到的菌株进行鉴定，通过观察菌落形态、显微镜下菌体形态观察、革兰染色、16SrDNA扩增以及DGGE等分子生物学手段相结合的方法进行了菌株的鉴定等，依照微生物学细菌分类鉴定实验方法，对获得的菌株进行初步鉴定。1.5DNA提取及PCR-DGGE技术1.5.1样品准备和细菌DNA提取取分离纯菌株的液体培养液于8ml离心管中，8000r/min，4℃，离心20min，弃上清液，取沉淀，加入0.5mlDNA提取缓冲液(1mol/LTris-HCl，pH8.0)备用。单菌株DNA的提取采用BenzylChloride方法［13］。1.5.2PCR扩增PCR扩增采用AmpliTaqGoldTM反应系统(PerkinElmer，AppliedBiosyst-ems，NJ，USA)。引物为357F和517R，它们的序940卫生研究第41卷列分别为5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。PCR的反应程序:95℃10min;下面的程序进行25个循环，93℃1min，50℃1min，72℃1min30s;之后，93℃1min，50℃1min，72℃5min。反应体系(50μl):1μldNTP(10mmol/L)、5μl10×PCRGoldBuffer、4μlMgCl2(25mmol/L)、0.5μl357F(45pmol/μl)、0.5μl517R(45pmol/μl)、1μl模板DNA(10ng/μl)和0.5μlTaq酶(2U/ml)，其余体积用无菌水补充。PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测，经纯化后送测序公司测序，所获得的DNA序列与BLAST程序的数据库序列比较，确定菌株的分类地位。1.5.3DGGE电泳及分析采用DCode系统(Bio-Rad，Laboratories，Hercules，Calif)对PCR扩增产物用双变性法进行DGGE分析［14］。聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%～12%，尿素变性梯度为20%～55%(尿素为7mol/L，甲酰胺为40%时的变性浓度为100%)，在61℃恒温下，电压为200V时电泳5h，采用SYBRGREENⅠ(MolecularProbes，Eugene，Ore)染色30min，紫外凝胶成像系统分析结果［15］。1.6水质净化试验设计试验水体取自北京动物园内有代表性的水域———污染比较严重的水禽湖，水体COD为87.6mg/L，TN为1.55mg/L，TP为0.15mg/L，pH为7.3。将取回的水样分装在3L的锥形瓶中，每个瓶中装1L水，菌液的添加量为处理水体积的0.05‰、0.1‰和0.2‰。分别用灭菌后的100ml离心管在无菌条件下取富集好光合细菌培养物，用无菌生理盐水离心洗涤2～3次(4000r/min，每次10min)，再用无菌生理盐水稀释至相同体积，振荡混合均匀，制成菌体悬液于4℃冰箱中保存备用。投加微生物后以及微生物处理5天后，分别取样，测定水体中的COD、TP、TN。研究所筛光合细菌是否具有脱氮除磷、去除有机物能力。1.7化学指标测定方法［16］总氮(TN)为紫外分光光度法，总磷(TP)为钼锑抗分光光度法，化学需氧量(COD)为重铬酸钾氧化法，pH采用pH计进行测定。2结果2.1光合细菌的富集培养将采集的沉积物接种到紫色非硫细菌液体富集培养基中，经过7天左右，培养液开始出现浅红色，经4～5次转接培养后，颜色逐渐加深，呈紫红色，此时主要是紫色非硫细菌科的混合菌。2.2细胞形态特征和菌落特征采用平板分离的方法得到纯菌株，命名为VOTO1-G，该菌株在光照厌氧和黑暗好氧条件下均能生长，属于兼性厌氧菌。VOTO1-G菌株革兰染色为阴性，单个细胞为卵形或短杆状(图1)，菌体大小为(0.6～0.9)×(1.2～2.0)μm。单菌落在分离固体培养基上呈棕红色(图2)，直径1～2mm，表面光滑湿润，中央突起，边缘整齐。图1菌株VOTO1-G的显微照片Figure1LightmicrographofstrainVOTO