应用于废水处理的光合细菌混合培养条件的优化

应用于废水处理的光合细菌混合培养条件的优化摘要［目的］研究光合细菌混合培养的最佳条件。［方法］对沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌和球形红假单胞菌混合培养的环境条件和培养基组分进行了优化试验。［结果］光合细菌混合培养的最佳环境条件为:接种量25%，培养基初始pH为7．0，光照度为5000lx，温度为30℃;培养基最佳碳氮比为4∶1。［结论］为光合细菌的产业化应用提供了指导。关键词光合细菌;混合培养;培养条件;生长曲线OptimizationofCulturalConditionsforMixedPhotosyntheticBacteriaUsedforWastewaterTreatmentAbstract［Objective］Theaimwastoobtaintheoptimumculturalconditionsformixedphotosyntheticbacteria．［Method］Optimizedtestwascarriedoutundertheenvironmentandmediumcomponentsonthemultiplicationofmixedphotosyntheticbacteria(Rhodopseudomonaspalus-tris，RhodopseudomonascapsulateandRhodopseudomonasspheroides)．［Result］Theresultsshowedthattheoptimumconditionswere25%in-oculumsdensity，7．0initialpH，5000lxilluminationintensityand30℃temperature．TheoptimumratioofC/Nwas4∶1．［Conclusion］Itwouldprovideguidancesforindustrializedapplicationofphotosyntheticbacteria．KeywordsPhotosyntheticbacteria;Mixedculture;Culturecondition;Growthcurve光合细菌(PhotosyntheticBacteria，PSB)是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物，是一大类水生的，能够在厌氧光照、好氧光照、好氧黑暗等条件下进行不放氧光合成代谢的细菌类群的总称［1］。根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)，PSB可分为紫色细菌和绿色硫细菌，尤其是红螺菌科(Rhodospirillaceae)的细菌具有丰富的代谢多样性，能根据外界条件的变化改变自身的代谢方式。因此，PSB在染料、芳香化合物等有机废水的处理中得到广泛的应用［2－4］。然而，由于纯菌株在培养过程中环境适应性较低，易受杂菌污染，PSB纯培养物在应用过程中的作用效率大大低于实验室［5］，因而，不少学者试图通过微生物的混合培养，以提高其环境适应性。目前，关于PSB混合培养方面的研究［6］较少。为此，笔者以沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌和球形红假单胞菌为研究对象，综合考察了培养环境条件和培养基组分对PSB混合培养生长的影响，以期为PSB的大规模培养及其在废水处理中的应用提供技术资料和菌种资源。1材料与方法1．1试验材料1．1．1菌株。PSB菌株:沼泽红假单胞菌(Rhodopseudo-monaspalustris)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonascapsula-ta)和球形红假单胞菌(Rhodopseudomonasspheroides)，保存于浙江工商大学。1．1．2培养基。基础培养基:CH3COONa1．4g，NaCl1．0g，NH4Cl0．6g，MgSO40．2g，CaCl20．05g，KH2PO40．6g，K2HPO41．5g，FeSO40．01g，微量元素MnSO42．0mg，Cu(NO3)20．2mg，Zn(NO3)20．25mg，Na2MoO40．7mg，H3BO32．0mg，谷氨酸0．2mg，生物素0．15mg，蒸馏水1L，pH7．0。1．1．3试验仪器。主要仪器:光照培养箱LRH-250-G;紫外分光光度计JASCOV-550;酸度计PHS-25;电子天平;实验室常用玻璃仪器等。1．2试验方法1．2．1PSB混合种子液准备。将实验室保存的沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌和球形红假单胞菌活化培养并分别稀释平板计数，然后，将沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌和球形红假单胞菌按菌落数1∶1∶1进行混合，即为PSB混合种子液。1．2．2PSB混合培养环境条件优化。将PSB混合种子液接种于一定量基础培养基的锥形烧瓶中，光照培养7d;进行接种量(10%、20%、25%、30%、40%)、培养基初始pH(6、7、8、9、10)、光照强度(2000、3000、4000、5000、6000lx)及培养温度(25、30、35、40℃)优化试验，每隔1d取样测量菌悬液浓度。1．2．3PSB混合培养基组分优化。碳源和氮源的量(即碳氮比)是影响细菌大量增殖的重要因素。在上述获得的最佳培养条件下，将PSB混合种子液接种于一定量基础培养基的锥形烧瓶中，光照培养7d，进行碳源(0．6、1．2、1．8、2．4、3．0g/L)和氮源(0．3、0．6、0．9、1．2、1．5g/L)优化试验，每隔1d取样测量菌悬液浓度。1．3分析方法1．3．1混合PSB生长的测定。采用分光光度计法，测定PSB菌悬液在550nm处的吸光度值。1．3．2数据处理。采用MicrosoftExcel2003软件处理，所用数据均为3次测定的平均值。2结果与分析2．1接种量对PSB混合培养的影响将初始OD550=2．8的混合PSB种子液按10%、20%、25%、30%、40%(V/V)接种量接种于一定量基础培养基的锥形瓶中，在光照培养箱中培养7d，每24h取样测定生长情况。结果表明(图1)，随着接种量的增加，培养至稳定期菌体量逐渐增加，然而，当接种量大于30%，培养1d后PSB生长速率明显变慢。另外，考虑到接种量大必然会增加大规模培养的成本，因此选择培养PSB适宜的接种量为25%左右。安徽农业科学，JournalofAnhuiAgri．Sci．2011，39(15):9151－9153责任编辑罗芸责任校对李岩图1接种量对PSB生长的影响Fig．1TheinfluenceoftheinoculumsonthegrowthofPSB2．2初始pH对PSB混合培养的影响将初始OD550=2．8的混合PSB种子液按25%的接种量接种于一定量基础培养基的锥形瓶中，分别调节培养基初始pH为6、7、8、9、10，在光照培养箱中培养7d，每24h取样测定生长情况。结果表明(图2)，当培养基初始pH6～10时，PSB均能生长，说明混合PSB有较强的环境适应性，当pH为7．0时，PSB的生长情况最好，菌体量最大。当pH为6．0时，PSB在第1天内处于生长停滞期，而后进入对数期，这可能是PSB不适宜在弱酸性环境下生长，但在PSB代谢过程中会释放出碱性物质，使培养液pH重新升高的缘故［7］。图2初始pH对PSB生长的影响Fig．2TheinfluenceofinitialpHonthegrowthofPSB2．3光照强度对PSB混合培养的影响将初始OD550=2．8的混合PSB种子液按25%的接种量接种于一定量基础培养基的锥形瓶中，培养基初始pH为7．0，分别设置光照度为2000、3000、4000、5000和6000lx，在光照培养箱中培养7d，每24h取样测定生长情况。结果显示(图3)，光照强度越大，PSB生长越快，当光照强度为5000lx时，PSB生长稳定，3d后培养成熟，菌悬液颜色为深红色，培养好的菌液能够保持较高的活性;当光照强度为6000lx时，PSB生长也较为迅速，但菌体易老化。因此，混合PSB生长的适宜光照强度为5000lx。2．4温度对PSB混合培养的影响将初始OD550=2．8的混合PSB种子液按25%的接种量接种于一定量基础培养基的锥形瓶中，培养基初始pH为7．0，光照度为5000lx，温度分别设置为25、30、35、40℃，培养7d，每24h取样测定生长情况。结果显示(图4)，PSB在25～40℃的温度范围内均能图3光照强度对PSB生长的影响Fig．3TheinfluenceofilluminationintensityonthegrowthofPSB生长，但温度过高或过低都不利于PSB的生长。温度过高可能会导致蛋白质或核酸的变性失活，进入对数期的时间延长;温度过低，细胞活性不足，菌体量相对较少;但高温对菌体生长的影响较为明显。在温度为30～35℃时，PSB生长状况良好，故在大规模培养中可以选择30℃作为培养温度，并且3d后就能终止培养，用于废水处理等。图4温度对PSB生长的影响Fig．4TheinfluenceofdifferenttemperaturesonthegrowthofPSB2．5培养基碳氮比的优化在最佳环境条件下将初始OD550=3．8的混合PSB种子液接种于一定量基础培养基的锥形瓶中，光照培养7d，碳源含量分别为0．6、1．2、1．8、2．4和3．0g/L，得出较优碳源添加量，在最佳碳源条件下再进行氮源(0．3、0．6、0．9、1．2、1．5g/L)优化试验，从而得出最佳碳氮比。结果表明(图5)，当醋酸钠添加量过低时，PSB生长缓慢，对数期不明显，菌体量也较少;而当醋酸钠浓度为3．0g/L时，PSB生长迅速，对数期较长，但4d后迅速进入老化衰退期。综合考虑，当醋酸钠浓度为2．4g/L时，PSB生长良好且稳定，故选择其作为最优碳源添加量。由图6可知，当氮源浓度较低时，菌体量不足，而当氮源浓度较高时，菌体的生长又会受到一定的抑制作用，故得出最佳氮源添加浓度为0．6g/L，从而确定培养基的最佳碳氮比为4∶1。2．6最佳培养条件下PSB生长曲线在上述最佳条件下，对PSB混合培养进行跟踪测试，观测其OD550值，并绘制生长曲线。结果表明(图7)，经过12h的生长停滞期，PSB进入快速增殖的对数期，3d后基本进入生长平稳期，菌体能保持较长时间的活性，而一般来说，生长对数期的菌体细胞活性最高，此时细胞需要消耗大量营养物质用于生长繁殖，9152安徽农业科学2011年图5碳源量对PSB生长的影响Fig．5TheinfluenceofcarbonconcentrationonthegrowthofPSB图6氮源量对PSB生长的影响Fig．6TheinfluenceofoxygenconcentrationonthegrowthofPSB因此也是废水处理的较佳时期。建议在实际废水处理当中以3～4d作为一个周期，定期补加新鲜菌液。此外，由2．5可知，试验中PSB能够利用氯化铵作为生长的氮源，具有一定的氨氮耐受性，这也为城市生活污水的处理提供了新思路。3结论研究对沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌和球形红假单图7PSB生长曲线Fig．7ThegrowthcurveofPSB胞菌三菌株的混合培养条件进行了优化，在最佳环境条件下，PSB混合菌繁殖速度快，培养液起初为淡红色，后转为浅红色，最后呈深红色。最佳培养条件为:接种量25%，培养基初始pH7．0，光照度5000lx，温度30℃;在此基础上，对培养基的碳氮比进行了优化，其最优碳氮比为4∶1。由于混合培养不需要灭菌等特点，因此较易实现产业化应用。该研究为光合细菌的大规模培养及其在废水处理中的正确使用提供了指导。参考文献［1］MADUKASIEI，DAIX，HEC，etal．Potentialsofphototrophicbacteriaintreatingpharmaceuticalwastewater［J］．IntJEnvironSciTech，2010，7(1):165－174．［2］李可，张肇铭，曹养宪．沼泽红假单胞菌对活性紫KBR脱色的研究［J］．中国环境科学，2004，24(3):299－302．［3］牛志卿，吴